楊樹(shù)轉(zhuǎn)錄因子ERF76基因耐鹽功能研究.pdf

1、轉(zhuǎn)錄因子以反式作用因子的形式與基因啟動(dòng)子序列中的順式作用元件特異性結(jié)合，通過(guò)與其他相關(guān)蛋白之間的互作來(lái)激活或者抑制轉(zhuǎn)錄，從而調(diào)控下游靶基因的表達(dá)。ERF家族基因是一類植物中特有的與植物生長(zhǎng)發(fā)育和生物、非生物脅迫應(yīng)答相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子基因。通過(guò)RNA-Seq方法篩選楊樹(shù)中應(yīng)答鹽脅迫的ERF基因，結(jié)果顯示在所有上調(diào)表達(dá)的ERF家族基因中，轉(zhuǎn)錄因子ERF76基因的相對(duì)表達(dá)量變化最顯著。
　　利用RT-qPCR對(duì)ERF76基因在3個(gè)不同組織和

2、5個(gè)不同鹽脅迫時(shí)間點(diǎn)的時(shí)空表達(dá)模式進(jìn)行分析，結(jié)果顯示ERF76基因在根莖葉中均有表達(dá)，在根中相對(duì)表達(dá)水平最高，依次是葉和莖，在脅迫3-36 h時(shí)間段內(nèi)，該基因在根莖葉中相對(duì)表達(dá)水平達(dá)到峰值的時(shí)間點(diǎn)均在12h。
　　利用巢式PCR從小黑楊基因組中克隆出ERF76基因上游1.5 kb的DNA序列。元件預(yù)測(cè)顯示，ERF76基因啟動(dòng)子序列中包含轉(zhuǎn)錄、植物脅迫應(yīng)答和植物生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)的順式作用元件。利用酵母單雜交鑒定與ERF76基因啟動(dòng)子互作

3、的蛋白包括轉(zhuǎn)錄、氧化還原酶活性、植物防御和應(yīng)激反應(yīng)、植物生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)蛋白。利用RT-qPCR、GUS染色和GUS熒光定量檢測(cè)轉(zhuǎn)基因擬南芥中不同啟動(dòng)子片段驅(qū)動(dòng)GUS基因表達(dá)情況，結(jié)果表明不同長(zhǎng)度的ERF76啟動(dòng)子片段具有不同轉(zhuǎn)錄激活活性和應(yīng)答鹽脅迫功能。
　　利用RT-PCR從小黑楊中克隆出1537 bp編碼ERF76基因的cDNA片段。亞細(xì)胞定位結(jié)果顯示ERF76蛋白定位在細(xì)胞核中。利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤轉(zhuǎn)化法獲得CaMV35S啟動(dòng)

4、子驅(qū)動(dòng)下的ERF76基因過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因煙草和轉(zhuǎn)基因小黑楊。在鹽脅迫條件下，轉(zhuǎn)基因煙草和轉(zhuǎn)基因小黑楊的株高、根長(zhǎng)、鮮重、抗氧化酶活性、抗逆境保護(hù)分子含量和相對(duì)含水量均高于非轉(zhuǎn)基因株系，植物體內(nèi)活性氧的積累和相對(duì)電導(dǎo)率均低于非轉(zhuǎn)基因植株。轉(zhuǎn)基因楊樹(shù)與野生型楊樹(shù)相比具有明顯的表型差異，轉(zhuǎn)基因楊樹(shù)中的ABA和GA相對(duì)含量明顯高于野生型。轉(zhuǎn)基因楊樹(shù)中ERF76基因、一些脅迫相關(guān)基因及植物激素合成相關(guān)基因的mRNA豐度顯著高于非轉(zhuǎn)基因楊樹(shù)。轉(zhuǎn)基因楊樹(shù)