楊樹應答鹽脅迫ERF基因的鑒定及功能分析.pdf

1、AP2/ERF(APETALA2/ethylene responsive factor)轉(zhuǎn)錄因子家族是植物特有的一類轉(zhuǎn)錄因子基因家族之一，其成員大都含有1～2個由約60個保守的氨基酸殘基組成的AP2/ERF結(jié)構(gòu)域。AP2/ERF結(jié)構(gòu)域可以直接與DREB/CRT或GCC-box順式作用元件互作，調(diào)控下游靶基因的表達，從而調(diào)節(jié)植物的生長發(fā)育及應答逆境脅迫。
　　本研究通過生物信息學分析獲得209個楊樹ERF轉(zhuǎn)錄因子的信息，其中超過82

2、％的轉(zhuǎn)錄因子含有相似的、完整的保守AP2/ERF結(jié)構(gòu)域，8個沒有或者含有不完整的AP2/ERF結(jié)構(gòu)域。根據(jù)AP2/ERF結(jié)構(gòu)域的不同分為Ⅰ～Ⅹ組，Ⅰ～Ⅴ組屬于CBF/DREB亞族(Group A)，Ⅵ～Ⅹ屬于ERF亞族(Group B);基因結(jié)構(gòu)分析顯示68個楊樹ERF轉(zhuǎn)錄因子基因含有內(nèi)含子，其中5個含有1個以上內(nèi)含子，并且含有內(nèi)含子的基因主要分布在Ⅰ、Ⅱ、Ⅶ、Ⅷ組中;蛋白結(jié)構(gòu)分析顯示208個（除了PtERF139）楊樹ERF轉(zhuǎn)錄因子均

3、含有motif-1(WLG)，且motif-6主要存在于DREB亞族中;AYD和AHD元件分別主要存在于ERF和DREB亞族轉(zhuǎn)錄因子中;氨基酸殘基富集區(qū)(acid-rich region)廣泛存在于各保守元件中;根據(jù)楊樹轉(zhuǎn)錄組測序表明，209條楊樹ERF轉(zhuǎn)錄因子基因根據(jù)其表達模式的不同分為三組:低表達量組(L)、中表達量組（M1和M2）、高表達量組（H1和H2）。表達量較高的ERF基因主要分布在第Ⅱ、Ⅴ、Ⅵ、Ⅷ、Ⅸ組中。
　　利用

4、RT-qPCR檢測114個ERF候選基因應答鹽脅迫情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)59個楊樹ERF基因應答鹽脅迫。其中，上調(diào)表達基因48個，下調(diào)表達基因11個。在上調(diào)表達基因中，上調(diào)表達2-4倍的29個，4-8倍的7個，8-16倍的4個，16-32倍的2個，32倍以上的基因有6個;組織特異性表達分析發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)楊樹ERF基因在葉片中的表達水平顯著高于在莖中的表達水平，位于L1位置葉片中ERF基因表達水平明顯低于其他位置葉片的表達水平，莖中ERF基因的表達

5、模式和葉片組織中類似，即最頂端S1位置莖中表達水平最低，其他不同位置莖中的基因表達水平?jīng)]有明顯差異;13個應答鹽脅迫的候選基因的時空表達表現(xiàn)出組織特異性，高表達的基因在根中表現(xiàn)出“誘導表達——恢復表達”的表達模式，不同表達水平的基因在不同組織中表達模式存在差異。其中，PtERF136與其他基因表達模式明顯不同，在莖中的表達水平顯著高于在其它組織部位中的表達水平。
　　構(gòu)建pBI121-PtERF3、pBI121-PtERF37、p

6、BI121-PtERF136、pBI121-PtERF159植物表達載體，培育轉(zhuǎn)基因擬南芥。在鹽脅迫條件下，轉(zhuǎn)基因擬南芥的耐鹽能力明顯高于非轉(zhuǎn)基因株系，說明ERF基因在提高植物耐鹽脅迫方面具有重要作用;構(gòu)建亞克隆載體pUC18-35 S-PtERF3-GFP、pUC18-35 S-PtERF37-GFP、pUC18-35 S-PtERF136-GFP、pUC18-35 S-PtERF159-GFP，蛋白質(zhì)亞細胞定位表明PtERF3、Pt

7、ERF136和PtERF159為全表達蛋白，而PtERF37定位在細胞核上;擬南芥轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)PtERF37基因擬南芥中AT3G04720.1、AT1G73260.1、AT3G05640.1、AT5G15230.1、AT1G06160.1、AT5 G4442n1、AT3G04720.1和AT2G26020.1等脅迫相關(guān)基因的表達水平發(fā)生明顯變化，說明PtERF37基因能夠激活或抑制轉(zhuǎn)基因植物內(nèi)源抗逆相關(guān)基因表達，提高植物耐鹽脅