小麥漸滲系山融3號(hào)鹽脅迫應(yīng)答基因TaHB30和TaCHP的功能鑒定.pdf

1、小麥作為世界上分布最廣、種植面積最大、加工制品最為豐富的糧食作物之一，其農(nóng)業(yè)地位的重要性不可忽視。然而隨著水資源的日益匱乏及土地荒漠化的日趨嚴(yán)重，非生物脅迫如高鹽、干旱等對(duì)小麥品質(zhì)的提高及產(chǎn)量的增加形成了較大的負(fù)面影響。加之非生物脅迫應(yīng)答是由多基因控制的復(fù)雜性狀，涉及到細(xì)胞防御、離子平衡、次生代謝以及能量代謝等諸多方面。且小麥作為異源六倍體，同擬南芥等模式植物相比，耐鹽機(jī)制研究的復(fù)雜性相應(yīng)增加，生長(zhǎng)周期也相對(duì)延長(zhǎng)，因此，即便與水稻、玉米

2、等其他作物相比，小麥逆境分子機(jī)理的研究仍然進(jìn)展緩慢。
　　 由于小麥屬于甜土植物，自身耐鹽能力不強(qiáng)，而其野生近緣物種則是抗逆改良的重要基因庫(kù)，可作為基因工程和細(xì)胞工程技術(shù)培育耐逆新品種的重要基因源。本實(shí)驗(yàn)利用不對(duì)稱體細(xì)胞雜交漸滲技術(shù)，獲得了鹽敏感小麥品種濟(jì)南177（Triticumaestivum2n=42，JN177）與強(qiáng)耐鹽性小麥近緣屬長(zhǎng)穗偃麥草(Thinopyrumponticum，2n=70)的漸滲系抗鹽新品種山融3號(hào)(

3、SR3)。山融3號(hào)的耐鹽指數(shù)及各項(xiàng)生理生化指標(biāo)均明顯優(yōu)于親本小麥JN177，其耐鹽性由主效基因和微效基因共同控制。
　　 在本實(shí)驗(yàn)前期對(duì)SR3全基因組芯片和蛋白組分析的基礎(chǔ)上，我們發(fā)現(xiàn)兩個(gè)受脅迫表達(dá)變化的基因，結(jié)合SR3鹽脅迫cDNA全長(zhǎng)文庫(kù)和RACE手段，獲得基因全長(zhǎng)。下面分別對(duì)兩個(gè)基因進(jìn)行功能驗(yàn)證，主要的研究?jī)?nèi)容及結(jié)果包括:
　　 1.小麥耐鹽相關(guān)基因TaHB30的克隆及初步功能分析
　　 通過(guò)分析SR3鹽脅

4、迫cDNA全長(zhǎng)文庫(kù)基因，發(fā)現(xiàn)了一個(gè)受鹽脅迫表達(dá)顯著上調(diào)的基因，依據(jù)文庫(kù)編號(hào)將其命名為TaHB30。在對(duì)其編碼的蛋白序列進(jìn)行Blast分析時(shí)，發(fā)現(xiàn)該基因含有Cu/Zn超氧化物歧化酶典型的激活位點(diǎn)，并包含有4個(gè)Cu2+結(jié)合位點(diǎn)和4個(gè)Zn2+結(jié)合位點(diǎn)，將其歸類于Cu/Zn超氧化物歧化酶大類。
　　 200mMNaCl處理?xiàng)l件下，在SR3及其親本JN177根葉中總體為上調(diào)的表達(dá)趨勢(shì);10mM過(guò)氧化氫處理后，根部的變化情況SR3同JN17

5、7較為一致，都呈現(xiàn)先下調(diào)后上調(diào)的波動(dòng)變化。葉中SR3仍為先下調(diào)后上調(diào)的趨勢(shì)，而JN177則是下調(diào)表達(dá)。在這些處理中，TaHB30在SR3中的表達(dá)量均高于JN177。
　　 由于Cu/Zn超氧化物歧化酶在植物細(xì)胞中分布比較廣泛，為確定TaHB30的功能作用部位，對(duì)基因表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行亞細(xì)胞定位。通過(guò)該蛋白偶聯(lián)GFP，基因槍法轉(zhuǎn)化洋蔥表皮細(xì)胞和PEG誘導(dǎo)擬南芥原生質(zhì)體，GFP熒光信號(hào)一致出現(xiàn)在細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞核中，表明該基因產(chǎn)物主要在胞質(zhì)同

6、核中起作用。
　　 構(gòu)建TaHB30表達(dá)載體并分別轉(zhuǎn)化擬南芥和小麥，對(duì)擬南芥過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因株系(OE系)在多種逆境脅迫下的表型進(jìn)行分析。在對(duì)照條件下，OE系和對(duì)照株系生長(zhǎng)狀況正常，沒(méi)有明顯差異;在不同濃度的Mannitol處理下，OE系與對(duì)照株系差異也不明顯。但當(dāng)NaCl濃度增加到50mM以后，OE系的生長(zhǎng)狀態(tài)明顯好于對(duì)照株系，主根根長(zhǎng)同對(duì)照植株相比較長(zhǎng)，側(cè)根的生長(zhǎng)也比對(duì)照株系發(fā)達(dá)。在添加H202的培養(yǎng)基上，OE系的生長(zhǎng)狀況也明顯

7、優(yōu)于對(duì)照株系。隨后進(jìn)行了不同種類激素，包括IAA、JA、ABA與GA3的處理，在對(duì)照和轉(zhuǎn)基因株系中都未發(fā)現(xiàn)表型的明顯差異。初步推測(cè)，TaHB30通過(guò)增強(qiáng)ROS途徑促進(jìn)OE系的耐鹽能力，同相關(guān)的植物激素信號(hào)通路沒(méi)有交匯。利用擬南芥突變體驗(yàn)證該基因功能，將TaHB30轉(zhuǎn)化擬南芥突變體，發(fā)現(xiàn)TaHB30過(guò)表達(dá)擬南芥突變體在正常條件下比對(duì)照系的根短，而在NaCl和H2O2的處理下這種根長(zhǎng)度的差異消除，推測(cè)與該基因調(diào)控?cái)M南芥內(nèi)源ROS的信號(hào)途徑有

8、關(guān)。
　　 RT-PCR和realtimePCR結(jié)果顯示，正常生長(zhǎng)條件下，擬南芥過(guò)表達(dá)株系(OE1，OE2)本底的超氧化物歧化酶(SOD)編碼基因比對(duì)照株系表達(dá)量增高;而其下游多個(gè)ROS清除酶編碼基因表達(dá)上調(diào):谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GPX)表達(dá)量的增幅最為顯著，其他如過(guò)氧化氫酶(CAT)、抗壞血酸過(guò)氧化物酶(APX)分別編碼的2個(gè)基因在OE系的表達(dá)量同對(duì)照也具有顯著差異。值得注意的是:位于ROS途徑上游、與H2O2產(chǎn)生密切相關(guān)的N

9、ADPH氧化酶編碼基因RBOH-D，RBOH-F的表達(dá)明顯提高，并且在同時(shí)含有H2O2和NADPH氧化酶抑制劑的培養(yǎng)基上，OE系的生長(zhǎng)狀況不再優(yōu)于對(duì)照株系;在正常條件下，TaHB30過(guò)表達(dá)擬南芥突變體的RBOH-D基因表達(dá)變化不顯著，而GPX基因的表達(dá)量對(duì)照系比較明顯上調(diào)。以上結(jié)果表明:小麥Cu/Zn超氧化物歧化酶基因TaHB30通過(guò)調(diào)控NADPH氧化酶的變化，進(jìn)入ROS信號(hào)途徑而在耐鹽中起作用。
　　 進(jìn)一步測(cè)定了OE系及空載

10、體對(duì)照的ROS相關(guān)酶活性，結(jié)果表明:OE系的ROS清除酶系統(tǒng)中總超氧化物歧化酶(SOD)和Cu/Zn超氧化物歧化酶的酶活力都較對(duì)照提高;過(guò)氧化氫酶(CAT)的酶活力約為對(duì)照的1.5-2倍;谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GPX)的酶活力約為對(duì)照的1.3倍。而ROS的產(chǎn)生酶-非特異性NADPH氧化酶(NOX)活性也在過(guò)表達(dá)擬南芥中明顯升高（1.6倍）;DAB染色顯示，TaHB30過(guò)表達(dá)株系中H2O2含量明顯低于對(duì)照植株;而NBT染色后，超氧陰離子的含

11、量高于對(duì)照植株。
　　 以上結(jié)果表明:TaHB30通過(guò)調(diào)節(jié)ROS信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)提高植物耐鹽性。
　　 2.小麥耐鹽相關(guān)基因TaCHP的功能分析
　　 通過(guò)本實(shí)驗(yàn)前期工作，發(fā)現(xiàn)了一個(gè)鹽脅迫應(yīng)答新基因TaCHP，編碼一個(gè)CHP-rich（半胱氨酸，組氨酸和脯氨酸豐富）的鋅指蛋白家族基因。TaCHP含有能特異性結(jié)合磷脂信號(hào)分子甘油二酯(DAG)的C1結(jié)構(gòu)域和可能的激酶結(jié)構(gòu)域，含有該結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)大多具有蛋白激酶（定位細(xì)胞

12、膜）和/或轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子（定位細(xì)胞核）活性。本研究發(fā)現(xiàn)，TaCHP定位在細(xì)胞膜和細(xì)胞核，推測(cè)是一個(gè)具有蛋白激酶和轉(zhuǎn)錄因子雙重功能的抗逆相關(guān)重要蛋白。體外PKC激酶活性測(cè)定表明，TaCHP表達(dá)蛋白無(wú)激酶活性。轉(zhuǎn)錄激活活性分析發(fā)現(xiàn)C'端兩個(gè)C1結(jié)構(gòu)域及TaCHP全長(zhǎng)具有轉(zhuǎn)錄激活活性，表明該基因可能作為一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子行使功能。
　　 進(jìn)行TaCHP脅迫表達(dá)模式及其定位分析，發(fā)現(xiàn)TaCHP主要在三葉期的小麥根部表達(dá)，原位雜交結(jié)果表明轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物

13、定位于根尖的皮層和分生組織細(xì)胞內(nèi)。TaCHP表達(dá)量在SR3中比親本JN177高，通過(guò)NaCl，干旱，ABA等處理后，二者都呈現(xiàn)下調(diào)趨勢(shì)。但是，SR3總體表達(dá)量均維持在比JN177明顯高的水平。
　　 將TaCHP轉(zhuǎn)化鹽敏感小麥濟(jì)南17，小麥的耐鹽、抗旱、抗氧化能力及相關(guān)生理生化指標(biāo)都明顯提高，證明了該基因的抗逆功能。構(gòu)建了TaCHP過(guò)表達(dá)(BS、A5)擬南芥株系，進(jìn)一步研究該基因可能的作用機(jī)制。除了耐鹽性以外，擬南芥對(duì)H2O2和

14、ABA的耐受性也有所增加。在鹽處理下，過(guò)表達(dá)系中一部分脅迫響應(yīng)基因(AtCBF3，AtDREB2A，AtABI2和AtABI1)的表達(dá)量升高，而ABA合成基因AtAAO3，AtABA2和AtMYB15的表達(dá)量降低。Real-timePCR顯示轉(zhuǎn)基因擬南芥BS、A5的AtRBOHD表達(dá)量平均增幅達(dá)7倍，其編碼的NADPH氧化酶是ROS產(chǎn)生的重要組成部分，而活性氧清除酶CAT和APX編碼基因AtCAT2、AtAPX2在擬南芥過(guò)表達(dá)株系中被誘