飯豆根尖早期鋁應(yīng)答基因的鑒定與功能分析.pdf

1、飯豆(Vigna umbellata)是一種在酸性土壤中生長(zhǎng)表現(xiàn)良好的豆類作物。前期研究表明，鋁(Al)誘導(dǎo)飯豆根尖檸檬酸的分泌有數(shù)小時(shí)的滯后期，暗示蛋白的重新合成是分泌所必需的，但這一過程中所涉及的調(diào)控基因仍不得而知;介導(dǎo)Al誘導(dǎo)飯豆檸檬酸分泌的轉(zhuǎn)運(yùn)子基因VuMATE1在無(wú)Al條件不被轉(zhuǎn)錄，而在Al脅迫下被大量誘導(dǎo)表達(dá)，因此鑒定飯豆早期Al響應(yīng)基因可以為飯豆根尖檸檬酸分泌調(diào)控提供有價(jià)值的信息;高濃度Al在顯著抑制根伸長(zhǎng)的同時(shí)往往會(huì)引發(fā)

2、細(xì)胞次級(jí)脅迫的產(chǎn)生，這不利于辨別真正的Al脅迫靶標(biāo)。在本研究中，為鑒定調(diào)控飯豆檸檬酸分泌的新組分，揭示飯豆Al耐性和毒性相關(guān)的分子機(jī)制。我們構(gòu)建了低濃度和高濃度Al脅迫早期的抑制差減文庫(kù)(Suppression subtractivehybridization，SSH)，從中鑒定了一批Al上調(diào)和下調(diào)的差異表達(dá)基因，并對(duì)其進(jìn)行了分析。同時(shí)，對(duì)其中一個(gè)潛在的可能參與檸檬酸分泌調(diào)控的轉(zhuǎn)錄因子基因VuSTOP1進(jìn)行了研究。主要研究結(jié)果如下：

3、r>　　⑴成功構(gòu)建了飯豆5和25μM AlCl3處理4h的正反向差減文庫(kù)。結(jié)合反向Nothern雜交和定量PCR鑒定到815個(gè)差異表達(dá)的EST序列，這些序列代表了394個(gè)Unigenes。根據(jù)Gene Ontology分類顯示，這些Unigenes可以被歸類為“信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄”，“轉(zhuǎn)運(yùn)”，“脅迫/防御應(yīng)答”，“代謝與能量”，“細(xì)胞壁合成與結(jié)構(gòu)”，“細(xì)胞分化與細(xì)胞骨架”，“蛋白質(zhì)翻譯進(jìn)程與降解”，“DNA與RNA代謝”，“未知功能”以及“

4、無(wú)匹配”10個(gè)功能大類。在已知功能基因中，與“代謝與能量”，“信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄”以及“轉(zhuǎn)運(yùn)”相關(guān)的基因被優(yōu)勢(shì)上調(diào)表達(dá)，而與“蛋白翻譯進(jìn)程與降解”相關(guān)的基因被優(yōu)勢(shì)下調(diào)表達(dá)。對(duì)兩個(gè)處理濃度下差異基因的表達(dá)譜分析發(fā)現(xiàn)，調(diào)控檸檬酸分泌基因的上調(diào)在飯豆應(yīng)答低濃度和高濃度Al脅迫的耐性機(jī)制中扮演了重要的作用;代謝（能量）和蛋白合成的改變是飯豆應(yīng)答Al脅迫時(shí)的自發(fā)適應(yīng)性機(jī)制并可能與Al的耐性相關(guān);高濃度Al對(duì)飯豆根伸長(zhǎng)的抑制可能與水分和礦質(zhì)營(yíng)養(yǎng)元素運(yùn)輸

5、以及細(xì)胞分化相關(guān)基因的下調(diào)有關(guān)。
　?、聘鶕?jù)文庫(kù)中鑒定到的EST序列信息，通過Rapid-amplification of cDNAends(RACE) PCR技術(shù)從飯豆中擴(kuò)增了一個(gè)STOP1類直系同源基因，命名為VuSTOP1。序列分析顯示，該基因cDNA全長(zhǎng)1772 bp，能夠剪切形成兩個(gè)轉(zhuǎn)錄本，其中VuSTO1.1長(zhǎng)1497 bp，編碼498個(gè)氨基酸，VuSTOP1.2長(zhǎng)1263 bp，編碼420個(gè)氨基酸。氨基酸同源性比對(duì)及

6、進(jìn)化樹分析表明，VuSTOP1與其它已知物種中的STOP1類蛋白一樣，擁有4個(gè)高度保守的Cys2His2鋅指蛋白結(jié)構(gòu)域，在進(jìn)化關(guān)系上，與菜豆親緣關(guān)系最近，其次是大豆。Southern雜交顯示，VuSTOP1是一個(gè)單拷貝基因。對(duì)兩個(gè)轉(zhuǎn)錄本的定量PCR分析表明，VuSTOP1.1與VuSTOP1.2表達(dá)模式基本一致，主要在飯豆根中表達(dá)，其中基本根(1-2 cm)中的表達(dá)量高于根尖(0-1 cm)，而在葉中的表達(dá)量最低，Al和蛋白合成抑制劑亞

7、胺環(huán)已酮(Cycloheximide)能顯著誘導(dǎo)其表達(dá)量的增加，低pH和重金屬鎘(Cd)可輕微上調(diào)其表達(dá)。進(jìn)一步對(duì)VuSTOP1基本特性進(jìn)行分析顯示，VuSTOP1定位于細(xì)胞核中，具有兩個(gè)轉(zhuǎn)錄激活域，分別位于N端1-78氨基酸殘基和C端389-498氨基酸殘基區(qū)間。利用擬南芥AtSTOP1啟動(dòng)子接VuSTOP1回復(fù)到擬南芥同源stop1突變體中發(fā)現(xiàn)，VuSTOP1可以通過回復(fù)AtSTOP1調(diào)控的H+耐性基因較大程度地回復(fù)stop1的H+