香蕉SOD基因家族的全基因組鑒定及功能分析.pdf

1、香蕉是熱帶和亞熱帶地區(qū)重要的經(jīng)濟(jì)和糧食作物。但在生產(chǎn)上，易受冬春季低溫和夏季干旱等不利環(huán)境的影響，而導(dǎo)致植株生長(zhǎng)發(fā)育受阻或減產(chǎn)，給蕉農(nóng)造成較大經(jīng)濟(jì)損失。逆境脅迫往往誘導(dǎo)植物細(xì)胞內(nèi)活性氧自由基的過(guò)量積累，進(jìn)而產(chǎn)生氧化脅迫，影響植物的生長(zhǎng)發(fā)育和結(jié)果。超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase, SOD）是抗氧化系統(tǒng)的第一道防線，能有效的清除活性氧并減輕氧化脅迫從而提高植物對(duì)逆境的耐受能力。已有研究表明香蕉SOD同工酶譜和酶活性

2、在低溫等非生物脅迫下發(fā)生顯著改變，說(shuō)明SOD與香蕉抗逆境過(guò)程密切相關(guān)。但目前對(duì)香蕉SOD基因及其表達(dá)的調(diào)控機(jī)制還知之甚少。因此，本研究以?xún)蓚€(gè)野生蕉的全基因組序列為參考，在栽培香蕉中對(duì)SOD基因家族進(jìn)行系統(tǒng)的克隆鑒定，分析不同成員的啟動(dòng)子序列和順式調(diào)控元件，對(duì)不同SOD基因成員在非生物脅迫和激素處理下的表達(dá)調(diào)控進(jìn)行研究，以探討SOD在香蕉抗逆過(guò)程中的作用。主要研究結(jié)果如下：
　　1.香蕉SOD基因家族的全基因組分析與克隆
　　

3、①采用計(jì)算機(jī)分析方法從小果野蕉DH-Pahang（Musa acuminata, AA genome）的全基因組中共檢索到15條SOD候選序列，其中2條為冗余序列。從野蕉PKW（Musa balbisiana, BB genome）的全基因組中共檢索到14條SOD候選序列，其中1條為冗余序列，2條為嵌合基因。
　?、诟鶕?jù)兩個(gè)野生蕉的SOD序列設(shè)計(jì)引物，以福建天寶蕉（Cavendish banana, AAA genome）為材料，

4、共克隆得到25條不同的SOD mRNA轉(zhuǎn)錄本。它們分別由6個(gè)Cu/ZnSOD基因、4個(gè)MnSOD基因和2個(gè)FeSOD基因轉(zhuǎn)錄?？勺兗艚印⒖勺冝D(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)和3’UTR選擇性多聚腺苷酸化是導(dǎo)致MaSOD基因mRNA多樣性的原因。
　?、垡訢NA為模板，克隆了12個(gè)MaSOD家族基因的gDNA序列，大小為1807~4720 bp。根據(jù)基因結(jié)構(gòu)不同分為4組：MaCSD1A、MaCSD1B、MaCSD1C和MaCSD1D共4個(gè)成員為Ia組，

5、均含有6個(gè)內(nèi)含子。MaCSD2A和MaCSD2B構(gòu)成Ib組，均含有7個(gè)內(nèi)含子。4個(gè)MnSOD（MaMSD1A、MaMSD1B、MaMSD1C和MaMSD1D）組成II組，均含有5個(gè)內(nèi)含子。III組包含MaFSD1A和MaFSD1B共2個(gè)成員，但它們的外顯子數(shù)目存在差異；MaFSD1A含有7個(gè)內(nèi)含子，而MaFSD1B含有8個(gè)內(nèi)含子。該分類(lèi)結(jié)果與MaSOD家族基因氨基酸序列的聚類(lèi)結(jié)果及根據(jù)它們保守基序的分類(lèi)結(jié)果一致。
　?、芪锓N內(nèi)和物

6、種間的共線性分析結(jié)果表明，全基因組復(fù)制和染色體區(qū)段復(fù)制是香蕉SOD基因家族數(shù)量擴(kuò)張的主要因素。
　?、輰?duì)不同基因組類(lèi)型香蕉SOD家族基因的比較分析結(jié)果表明，福建天寶蕉（AAA genome）的SOD基因與福州野生蕉（AA genome）和小果野蕉DH-Pahang（AA genome）的SOD基因有較高的一致性，但與野蕉PKW（BB genome）的SOD基因的一致性較低。
　　2.香蕉SOD基因家族編碼蛋白的生物信息學(xué)分析

7、
　　根據(jù)生物信息學(xué)分析結(jié)果，香蕉SOD家族基因編碼的蛋白與其他植物SOD具有很高的同源性，且都含有SOD保守結(jié)構(gòu)域和特征氨基酸位點(diǎn)，說(shuō)明他們?cè)谶M(jìn)化上較為保守，在功能上具有相似性。但不同MaSOD蛋白仍存在各自的特點(diǎn)。MaSOD蛋白家族的分子量大小在15037.6~34235.5 Da，其中FeSOD的分子量最大，MnSOD的分子量次之，Cu/ZnSOD的分子量最小。除了MaMSD1C為堿性蛋白，MaCSD2B和MaMSD1A為弱

8、堿性蛋白外，其余的成員均為酸性蛋白。除了MaFSD1A為不穩(wěn)定蛋白外，其余的11個(gè)成員均為穩(wěn)定蛋白。除了MaCSD2A和MaCSD2B為疏水性蛋白外，其余的均為親水性蛋白。MaCSD1的4個(gè)蛋白（MaCSD1A、MaCSD1B、MaCSD1C和MaCSD1D）由19種氨基酸組成，都不含有色氨酸；其余的MaSOD家族蛋白均由20種氨基酸組成。亞細(xì)胞定位分析顯示4個(gè)MaCSD1蛋白（MaCSD1A、MaCSD1B、MaCSD1C和MaCSD

9、1D）定位于細(xì)胞質(zhì)；2個(gè)MaCSD2蛋白（MaCSD2A和MaCSD2B）定位于葉綠體；4個(gè)MaMSD蛋白（MaMSD1A、MaMSD1B、MaMSD1C和MaMSD1D）定位于線粒體；而MaFSD1A主要定位于葉綠體，在細(xì)胞質(zhì)中也存在，MaFSD1B則主要定位于葉綠體。磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)分析結(jié)果表明不同MaSOD蛋白成員間的各種磷酸化位點(diǎn)的數(shù)量和位置存在明顯差異，說(shuō)明香蕉MaSOD家族的不同蛋白成員可能在翻譯后水平受不同的磷酸化方式調(diào)控表

10、達(dá)。
　　3.香蕉SOD基因家族啟動(dòng)子的克隆與分析
　　采用PCR法直接克隆得到MaSOD家族的11條大小在1084~2114 bp的5’端調(diào)控序列。序列分析顯示，它們不僅包含核心啟動(dòng)子區(qū)和啟動(dòng)子核心元件TATA-box和CAAT-box，還含有大量與光響應(yīng)、環(huán)境脅迫應(yīng)答、激素響應(yīng)和生理節(jié)律調(diào)控等相關(guān)的順式元件。對(duì)MaSOD基因家族不同成員的啟動(dòng)子順式元件的比較分析表明，不同成員的啟動(dòng)子間除了都含有各自特異的順式元件外，還具

11、有一些共有的順式元件以及響應(yīng)同一脅迫的不同順式元件。說(shuō)明在一定程度上，同一脅迫可以調(diào)控多個(gè)香蕉SOD成員的表達(dá)，但各個(gè)成員在響應(yīng)同一脅迫上又具有一定的差異性。
　　4.香蕉SOD基因家族在非生物脅迫和激素處理下的表達(dá)分析
　　qRT-PCR法分析MaSOD基因家族在不同組織部位的表達(dá)情況，結(jié)果表明除了MaCSD2B基因在假莖中未檢測(cè)到表達(dá)外，其余的11個(gè)成員在葉、假莖和根中都有表達(dá)。
　　qRT-PCR法分析MaSOD

12、基因家族在低溫、高溫、干旱和NaCl脅迫下的表達(dá)模式。結(jié)果表明香蕉MaSOD基因在不同非生物脅迫下，并非是簡(jiǎn)單的一對(duì)一響應(yīng)，而是存在較為復(fù)雜的綜合響應(yīng)。具體情況如下：在低溫脅迫48 h時(shí)，香蕉MaCSD2A基因顯著上調(diào)表達(dá)，而MaCSD1D和MaCSD2B則顯著下調(diào)表達(dá)，其余成員的表達(dá)差異不明顯。在高溫脅迫48 h時(shí)，有6個(gè)基因（MaCSD1B、MaCSD1D、MaMSD1A、MaMSD1B、MaMSD1C和MaFSD1A）呈現(xiàn)顯著上調(diào)

13、表達(dá)，只有MaCSD2A基因在12 h時(shí)顯著下調(diào)表達(dá)。而在干旱脅迫下，只有3個(gè)Cu/ZnSOD基因（MaCSD1B、MaCSD1C和MaCSD2A）在不同的時(shí)間點(diǎn)顯著上調(diào)表達(dá)；其余的成員多數(shù)表達(dá)量呈現(xiàn)下調(diào)，其中5個(gè)成員（MaCSD1A、MaCSD1D、MaMSD1A、MaMSD1B和MaFSD1B）表達(dá)量的下調(diào)倍數(shù)達(dá)2~10倍。高鹽脅迫顯著誘導(dǎo)MaCSD1D、MaMSD1A和MaMSD1B基因的表達(dá)，但抑制MaCSD2A和MaFSD1B

14、基因的表達(dá)。
　　qRT-PCR法分析MaSOD基因家族在脫落酸、赤霉素、生長(zhǎng)素和水楊酸4種激素處理下的表達(dá)模式。結(jié)果表明只有 MaCSD和 MaMSD亞家族的成員被顯著誘導(dǎo)表達(dá)，而 MaFSD亞家族的成員表達(dá)量變化不明顯。具體情況如下：在脫落酸處理下，MaCSD1D和MaMSD1A被誘導(dǎo)顯著上調(diào)表達(dá)。在赤霉素處理后，也僅有2個(gè)基因（MaCSD1D和MaMSD1A）在不同時(shí)間點(diǎn)顯著上調(diào)表達(dá)，其他成員的表達(dá)差異不顯著。生長(zhǎng)素處理則可

15、誘導(dǎo)3個(gè)MaCSD基因（MaCSD1A、MaCSD1D和MaCSD2B）和1個(gè)MaMSD基因（MaMSD1A）在不同時(shí)間點(diǎn)顯著上調(diào)表達(dá)。而水楊酸處理24 h時(shí)顯著誘導(dǎo)MaCSD1D的上調(diào)表達(dá)。
　　5.香蕉銅鋅超氧化物歧化酶MaCSD1D基因的功能分析
　　細(xì)胞質(zhì)型的MaCSD1D基因在非生物脅迫（冷、熱、干旱和鹽脅迫）和激素處理（ABA、GA3、IAA和 SA）下均有顯著的上調(diào)或下調(diào)表達(dá)，暗示該基因可能在香蕉的逆境脅迫中發(fā)

16、揮重要作用。為了進(jìn)一步揭示其功能，構(gòu)建 MaCSD1D基因的過(guò)表達(dá)載體并轉(zhuǎn)化煙草，對(duì)MaCSD1D基因在低溫脅迫下的功能進(jìn)行分析，結(jié)果表明轉(zhuǎn)MaCSD1D基因的煙草種子在低溫下的萌發(fā)速度和生長(zhǎng)狀況均優(yōu)于非轉(zhuǎn)基因煙草的種子。6片功能葉時(shí)期的轉(zhuǎn)基因煙草比非轉(zhuǎn)基因煙草對(duì)低溫脅迫表現(xiàn)出更強(qiáng)的耐受能力，且轉(zhuǎn)基因煙草在低溫下的SOD酶活性高于非轉(zhuǎn)基因煙草的SOD酶活性。
　　6.香蕉Cu/ZnSOD分子伴侶蛋白基因MaCCS的克隆與表達(dá)分析<

17、br>　　銅鋅超氧化物歧化酶（Cu/ZnSOD）是一種同時(shí)含銅和鋅的金屬酶，在正常生理?xiàng)l件下銅的獲取需要通過(guò)分子伴侶蛋白CCS來(lái)實(shí)現(xiàn)。本研究采用RT-PCR結(jié)合RACE-PCR獲得了1條新的CCS基因（MaCCS）。序列分析表明MaCCS具有典型的CCS結(jié)構(gòu)域和保守的基因結(jié)構(gòu)。MaCCS基因啟動(dòng)子上存在大量參與非生物脅迫和激素應(yīng)答的順式元件。qRT-PCR分析表明MaCCS基因在葉、假莖和根部均有表達(dá)，并參與非生物脅迫（CuSO4、熱、

18、冷和干旱）和激素（ABA和IAA）應(yīng)答。而且，MaCCS基因的轉(zhuǎn)錄模式在低溫脅迫下與MaCSD1B、MaCSD1D和MaCSD2B基因的相似，在熱脅迫下與MaCSD1B和MaCSD1D基因的相似，在干旱脅迫下與MaCSD1B和MaCSD1C基因的相似，在ABA和IAA處理下則與MaCSD1A、MaCSD1C和MaCSD2B基因的相似。這說(shuō)明在非生物脅迫和激素處理下，香蕉MaCCS基因在轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)與其對(duì)應(yīng)的MaCSD基因的表達(dá)呈現(xiàn)正相