黃萎病菌致病相關基因VdMsb的功能研究及棉花幾丁質相關基因家族的全基因組鑒定與功能分析.pdf

1、棉花（Gossypium spp.）是世界上重要的經(jīng)濟作物，棉纖維是紡織業(yè)原料的重要來源，同時棉籽也是重要的植物油脂資源。黃萎病菌（Verticillium wilt）是影響棉花生長發(fā)育的最重要真菌病害，嚴重影響棉花纖維品質和產(chǎn)量。棉花黃萎病菌致病機制及抗病基因的發(fā)掘與育種利用一直是棉花抗病遺傳育種研究的熱點。深入研究黃萎病菌中關鍵致病基因的功能特征，明確棉花抗病相關基因的作用機理，不僅為棉花與黃萎病菌互作機制的研究提供依據(jù)，而且可為棉

2、花抗病品種的培育提供重要的候選基因。
　　目前研究顯示，絲裂原激活蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinases，MAPK)信號在調節(jié)植物真菌菌絲生長、在寄主植物表面的附著生長、特殊的侵染結構、分泌細胞壁降解酶等方面起重要作用。研究者們已經(jīng)從多種植物病原菌中成功鑒定出多個MAPK通路基因，其中包括位于MAPK信號通路上游的Msb2基因。該基因是一種典型的膜結合型粘蛋白，參與信號傳導并且位于絲狀生長（F

3、ilamentous growth，F(xiàn)G）和高滲透壓調節(jié)（High osmolarity/glycerol pathway, HOG）信號途徑的上游，在植物病原菌侵染寄主植物過程中起著重要作用。而植物在抵抗真菌病害侵染過程中可通過感知病原菌相關分子模式（Pathogen-associated molecular patterns，PAMPs）來激活復雜的免疫反應，從而抵御病原菌的侵染。其中，病原真菌細胞壁的主要組成成分——幾丁質就是一類

4、PAMPs。目前研究顯示，植物體內存在著兩大類幾丁質相關基因:幾丁質受體蛋白與幾丁質酶。幾丁質酶通過降解真菌細胞壁釋放小分子幾丁寡糖，從而抑制真菌的生長。而幾丁質受體則可以特異性的識別上述幾丁寡糖，從而利用一系列的信號傳遞激活植物免疫反應。因此，這兩類幾丁質相關基因在植物免疫反應中起著重要作用。
　　本研究以黃萎病菌落葉型菌株Vd8為材料，克隆了VdMsb基因并初步研究其功能;利用已釋放的棉花二倍體亞洲棉（A組）和雷蒙德氏棉（D組

5、）的基因組數(shù)據(jù)，進行棉花幾丁質相關基因家族的全基因組發(fā)掘、分類及功能分析。主要研究結果如下:
　　1、利用同源克隆的方法，從黃萎病菌Vd8中克隆到一個膜結合型粘蛋白基因VdMsb（GenBank登錄號:KM032761）。該基因ORF全長2688bp，編碼含895個氨基酸的蛋白質，分子量和等電點分別為9.06 kD和4.33。生物信息學分析顯示，該基因的N-端包含一段由22個氨基酸殘基組成的信號肽，C-端包含一個由23個氨基酸殘基

6、組成的跨膜區(qū)域和一個由14個氨基酸殘基組成的高度保守的細胞質尾體。通過對基因全長進行糖基化位點預測，發(fā)現(xiàn)該基因一共包含178個糖基化位點。蛋白序列比較發(fā)現(xiàn)，黃萎病菌VdMsb蛋白與尖孢鐮刀菌FoMsb2和稻瘟病菌MoMsb2的相似度達到了49.27％和48.78％。不同來源的VdMsb類同源基因在跨膜區(qū)和細胞質尾體部分高度保守。
　　利用農(nóng)桿菌介導的遺傳轉化方法（Agrobacterium tumefaciens mediated

7、transformation，ATMT），成功獲得該基因的缺失及互補突變體。通過表型觀察發(fā)現(xiàn)，缺失突變體⊿msb的微菌核占整個菌落的比例顯著性下降，整個菌落呈現(xiàn)為白色。而互補突變體⊿msb+Msb相對于⊿msb突變體而言，表型恢復正常，與野生型Vd8表型相同。說明VdMsb基因有無與黃萎病菌微菌核的形成顯著相關。對不同突變體及野生型進行致病力分析發(fā)現(xiàn)，接種⊿msb突變體的棉花植株發(fā)病速度較為平緩，接種30天后平均病級指數(shù)為37.5％。相

8、對與野生型和互補突變體，致病力明顯下降。相似的結果也在接種擬南芥實驗中重演。說明VdMsb基因是黃萎病菌致病的關鍵基因。
　　進一步研究發(fā)現(xiàn)，野生型Vd8和⊿msb+ Msb突變體菌株樣品中孢子濃度無顯著性差異，分別為4.49±1.01×107和4.82±0.97×107個孢子。而⊿msb突變體菌株的產(chǎn)孢能力明顯下降，僅2.63±0.86×107個孢子。利用不同突變體及野生型菌株的孢子懸浮液處理擬南芥和棉花根部組織，以明確VdMs

9、b基因缺失突變體致病力下降的原因。通過電鏡掃描分析發(fā)現(xiàn)，缺失突變體⊿msb菌株在擬南芥根部附著的菌絲要明顯少于野生型Vd8和互補突變體⊿msb+Msb。黃萎病菌在棉花中侵入生長分析發(fā)現(xiàn)，接種野生型Vd8和⊿msb+ Msb突變體菌株的棉花幼苗莖稈中出現(xiàn)了維管束褐化現(xiàn)象，說明病原菌已經(jīng)進入棉花維管束;而接種⊿msb突變體菌株的棉花幼苗莖稈無明顯變化。以上結果說明，VdMsb基因與黃萎病菌的產(chǎn)孢能力、根部附著能力和侵入生長能力緊密相關，是黃

10、萎病菌關鍵的致病基因。
　　2、利用二倍體雷蒙德氏棉及亞洲棉全基因組序列信息對棉花LysM基因家族成員進行全基因預測。分別從A組和D組中獲得28和26個LysM基因。根據(jù)其結構域特征及聚類分析將上述基因分為LYK、LYP、LysMe和LysMn四類。染色體定位表明，LysM基因家族成員分布在12條染色體上。根據(jù)其在染色體上的位置依次命名為GrYK1-GrL YK8、GrLYP1-GrLYP4、GrLysMe1-GrLysMe7和G

11、rLysMn1-GrLysMn7,并按照同源性對A組成員進行命名。以棉花抗病品種海島棉Hai7124的根、莖和葉為材料，利用實時熒光定量PCR技術（qRT-PCR）共研究12個LysM基因在棉花不同組織器官中的表達特征。表達分析表明LysM類基因組織器官表達的多樣性。其中在根、莖和葉三種組織器官中都表達的基因有4個:GbLYP1、GbLYP2、GbLysMn3和GbLysMn7。在根中優(yōu)勢表達的基因有5個:GbLYK1、GbLYK5、G

12、bLYK7、GbLysMe1和GbLysMe2。從表達水平分析結果發(fā)現(xiàn)3個基因在根部表達量較高，分別是GbLYP1、GbLysMn7和Gb YK5。其中，GbLYP1和GbLYK5明顯受黃萎病菌誘導表達，而GbysMn7在病菌處理后表達水平未發(fā)生顯著性變化。
　　通過同源克隆技術，成功從海島棉Hai7124中克隆了GbLYP1和GbLYK5基因。其中，GbLYP1基因ORF全長1080bp，編碼359個氨基酸，分子量和等電點分別為

13、38.7kD和5.54Gb YK5基因ORF全長2013bp，編碼670個氨基酸，分子量和等電點分別為73.7kD和5.90。
　　VIGS實驗結果顯示，注射pTRV2-GbLYK5和pTRV2-GbLYP1的棉花幼苗真葉出現(xiàn)了嚴重的黃化、萎蔫和脫落等典型的黃萎病感病癥狀。病級指數(shù)分別達到了73％和66.7％，而對照組病級指數(shù)僅為35.4％。病級指數(shù)與目標基因未沉默的對照相比，存在著極顯著的差異。說明GbLYK5和GbLYP1基因

14、在棉花抗黃萎病過程中起重要作用。
　　3、利用二倍體雷蒙德氏棉及亞洲棉全基因組序列信息，從A組和D組中分別獲得49和46個幾丁質酶基因。根據(jù)其結構域特點及進化關系分為五類:ClassⅠ-Ⅴ。進一步對來源于雷蒙德氏棉D基因組的幾丁質酶基因家族成員進行染色體定位，發(fā)現(xiàn)46個幾丁質酶基因分布在12條染色體上。根據(jù)其在染色體上的位置依次命名為GrChi1-GrChi46，并按照同源性對A組成員進行命名。
　　利用同源基因相似性原理，

15、以棉花抗病品種海島棉Hai7124的根、莖和葉為材料，研究了37個幾丁質酶基因在棉花不同組織器官中的表達特征。表達分析發(fā)現(xiàn)，Chi類基因組織器官表達的多樣性。其中在根、莖和葉三種組織器官中都2個，GbChi31和GbChi46。在根部優(yōu)勢表達的基因有21個，其中GbChi3和GbChi22兩個基因的表達量最高。有7個基因在莖部優(yōu)勢表達，其余9個基因在葉中優(yōu)勢表達。黃萎病菌誘導表達分析發(fā)現(xiàn)，GbChi3、GbChi22、GbChi31和G

16、bChi46四個基因受黃萎病菌誘導后表達量顯著提高，其中GbChi22受黃萎病菌誘導表達量最高。
　　通過同源克隆技術，成功從海島棉Hai7124中克隆了GbChi22，該基因ORF全長1107bp，編碼368個氨基酸，分子量和等電點分別為93.6kD和5.04。其N端有信號肽結構(SP)，一個Glyco_hydro_18結構域，基因組序列中包含一個內含子。
　　利用病毒誘導的基因沉默技術，對GbChi22基因進行功能分析。