旱地棉(Gossypium aridum)耐鹽相關(guān)WRKY轉(zhuǎn)錄因子的全基因組鑒定、克隆及功能分析.pdf

1、為了適應(yīng)不良的生長環(huán)境，植物在長期的進(jìn)化過程中形成了一系列復(fù)雜而有效的應(yīng)對機(jī)制?，F(xiàn)有的研究表明，這種由于自身進(jìn)化而獲得的應(yīng)對機(jī)制主要是通過轉(zhuǎn)錄激活或轉(zhuǎn)錄抑制相關(guān)的基因的表達(dá)發(fā)生作用的。而在這一過程中，轉(zhuǎn)錄因子發(fā)揮著重要的作用，通過與其他相關(guān)蛋白或自身之間的相互作用激活或抑制相關(guān)靶基因的表達(dá)。近年來，研究顯示W(wǎng)RKY轉(zhuǎn)錄因子家族中眾多成員都參與植物的非生物脅迫響應(yīng)機(jī)制。目前已經(jīng)成為植物抗性功能研究中的一個熱點。但關(guān)于棉花，由于基因組大而復(fù)

2、雜，轉(zhuǎn)錄因子家族成員眾多，導(dǎo)致目前的研究還僅限于生物信息學(xué)分析、功能結(jié)構(gòu)域的預(yù)測分析等方面。對于單個基因的結(jié)構(gòu)、生理生化功能、靶基因及其鹽脅迫下的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)還很不清楚。本研究利用耐鹽堿棉屬二倍體野生種旱地棉，開展全基因組范圍耐鹽相關(guān)WRKY轉(zhuǎn)錄因子的篩選、鑒定及功能分析，是一種有意義的創(chuàng)新性探索。
　　主要研究如下:
　　1.利用生物信息學(xué)技術(shù)從本實驗室建立的棉屬野生種旱地棉的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中共獲得了109個WRKY類基因。對旱

3、地棉的109個GarWRKY基因的126個WRKY結(jié)構(gòu)域構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹進(jìn)行分類，發(fā)現(xiàn)第Ⅰ類有17個基因，第Ⅱ類有80個基因，第Ⅲ類僅有12個基因。這109個WRKY基因廣泛分布于棉花的13條染色體上，且絕大多數(shù)集中分布于染色體兩端。
　　2.基于鹽脅迫下旱地棉根和葉的表達(dá)譜分析，共篩選和克隆了28個鹽脅迫相關(guān)GarWRKY基因，提交GenBank，獲得登錄號為KM438453-KM438480。這些基因的ORF長度范圍從474bp

4、到1848bp，平均長度為1048bp，編碼的蛋白由157到615個氨基酸組成，平均長度為348個氨基酸。經(jīng)在線軟件亞細(xì)胞定位預(yù)測全部定位為細(xì)胞核。28個WRKY基因在旱地棉的根、莖、葉、花瓣、雄蕊和花萼組織表達(dá)特性分析表明WRKY基因并非在所檢測的組織中均有表達(dá)，有27個GarWRKY基因在根中表達(dá)，而只有6個基因在檢測的所有組織中都有表達(dá)。
　　3.QRT-PCR結(jié)果顯示，絕大多數(shù)GarWRKY基因在遭受鹽脅迫1小時后就會被激

5、活，在12或24小時時表達(dá)達(dá)到頂峰，然后在最后一個處理時間點(72h)回落到基礎(chǔ)水平。然而，在葉中，絕大多數(shù)GarWRKY基因是遭受鹽脅迫6時后才會被激活，在最后一個處理時間點(72h)表達(dá)達(dá)到頂峰。鹽脅迫下WRKY基因表達(dá)分析顯示絕大多數(shù)基因在葉中比根中感應(yīng)鹽脅迫要有所延遲
　　4.根據(jù)基因表達(dá)分析結(jié)果，將GarWRKY5（鹽脅迫后上調(diào)），GarWRKY17（鹽脅迫后上調(diào)）和GarWRKY22（鹽脅迫后下調(diào)）三個基因克隆到pCA

6、MBIA2301植物表達(dá)載體，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的浸花法成功獲得了轉(zhuǎn)基因擬南芥株系。T3代轉(zhuǎn)基因擬南芥表型及生理生化物質(zhì)分析結(jié)果表明，過表達(dá)GarWRKY5和GarWRKY17能夠增強(qiáng)轉(zhuǎn)基因擬南芥對高鹽脅迫的耐受能力，而過表達(dá)GarWRKY22卻加劇了轉(zhuǎn)基因擬南芥對高鹽脅迫的敏感性。VIGS分析表明缺失GarWRKY5和GarWRKY17基因的棉花突變體植株較對照組在鹽脅迫下表現(xiàn)出更嚴(yán)重的鹽害反應(yīng)，而與對照相比，GarWRKY22缺失突變體

7、沒有顯著差異表型。
　　5.對鹽脅迫下過表達(dá)GarWRKY17的轉(zhuǎn)基因擬南芥進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測序，利用數(shù)字表達(dá)譜分析法以及生物信息學(xué)獲得了11個GarWRKY17在棉花中的下游耐鹽相關(guān)靶基因，利用RT-PCR分析了這些基因鹽脅迫下的表達(dá)模式，最終闡明了GarWRKY17在鹽脅迫下調(diào)控其下游靶基因的復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)途徑，主要為(1)激活NRT1.8（NO3-轉(zhuǎn)運體）的表達(dá)，一方面將植物細(xì)胞內(nèi)的NO3-轉(zhuǎn)運到液泡中，通過調(diào)節(jié)離子的平衡來增加

8、植株的耐鹽力，另一方面促進(jìn)植物細(xì)胞對外界氮元素的吸收，通過NRT使氮素通過氨基酸代謝途徑以及次級代謝合成途徑合成一些有機(jī)滲透物質(zhì)進(jìn)行滲透調(diào)節(jié)，從而增加植物的耐鹽力;(2)激活Ca2+-transporting ATPase的活性，參與SOS途徑后通過Na+/K+離子轉(zhuǎn)運的反向離子轉(zhuǎn)運體將體內(nèi)多余的Na+排出體外，維持細(xì)胞內(nèi)的離子平衡，使植物免受鹽離子毒害而正常生長;(3)正常條件下，MYB102以及NAC3和WRKY17相結(jié)合抑制WRK

9、Y17的表達(dá)從而抑制植物的耐鹽力，當(dāng)植物受到鹽脅迫后，激活了編碼MYB102和NAC3轉(zhuǎn)錄因子的鑲嵌阻遏蛋白基因的表達(dá)，導(dǎo)致鑲嵌阻遇蛋白大量積累，從而抑制了MYB102以及NAC3和WRKY17之間的相互作用，進(jìn)而激活下游DREB類和ZAT耐鹽相關(guān)基因從而提高植物的耐鹽能力;(4)鹽脅迫增強(qiáng)GarWRKY17和GarWRKY28的相互作用，通過兩者的這種組合調(diào)控增強(qiáng)植物對鹽脅迫的應(yīng)答反應(yīng)的能力，從而提高植物對鹽的耐受性。
　　6.

10、對鹽脅迫下過表達(dá)GarWRKY22的轉(zhuǎn)基因擬南芥進(jìn)行了DGE分析，利用數(shù)字表達(dá)譜分析法，生物信息學(xué)以及RT-PCR獲得了14個GarWRKY22在棉花中的下游耐鹽相關(guān)靶基因，并最終預(yù)測了GarWRKY22在鹽脅迫可能的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)途徑，主要為(1)通過氨基酸代謝途徑以及次級代謝合成途徑合成一些有機(jī)滲透物質(zhì)進(jìn)行滲透調(diào)節(jié);(2)通過調(diào)控光合作用途徑中的電子轉(zhuǎn)運體以及相關(guān)酶類的活性來參與植物的鹽脅迫響應(yīng)機(jī)制;(3)通過調(diào)控參與植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑