紅樹耐鹽的比較基因組學(xué)研究及擬南芥AtJMJ24功能分析.pdf

1、生物主要通過轉(zhuǎn)錄調(diào)控來應(yīng)對(duì)外界環(huán)境刺激與內(nèi)在發(fā)育節(jié)律,植物自萌發(fā)以后便固駐一地,一生要經(jīng)受眾多的生物與非生物脅迫,同時(shí)基因組中大量的轉(zhuǎn)座子和重復(fù)序列等所謂的垃圾DNA對(duì)機(jī)體也是一種潛在的內(nèi)在“脅迫”,這些不利因素要求植物在基因組轉(zhuǎn)錄調(diào)控方面具備一套精確有效的調(diào)節(jié)機(jī)制。本論文第一部分選取紅樹為對(duì)象,研究了植物在高鹽脅迫下轉(zhuǎn)錄調(diào)控的特點(diǎn),第二部分采用擬南芥為模式,研究了表觀遺傳在轉(zhuǎn)錄沉默中的調(diào)控機(jī)制。
　　 近年來發(fā)展起來的新一代測(cè)

2、序技術(shù)帶來的測(cè)序革命為我們?cè)诜悄Ｊ轿锓N中開展基因組學(xué)研究提供了基礎(chǔ)。紅樹林是生長(zhǎng)于熱帶、亞熱帶海岸潮間帶的木本植物群落,其對(duì)于鹽生環(huán)境具有高度的適應(yīng)性,是一類極好的進(jìn)化與生態(tài)功能基因組學(xué)的研究模型。我們首先使用Solexa測(cè)序技術(shù)測(cè)定了紅樹植物角果木(Ceriops tagal)和其近緣的非紅樹植物旁杞木(Carallia longipes)在各自正常生境條件下的轉(zhuǎn)錄組,通過比較我們發(fā)現(xiàn)紅樹轉(zhuǎn)錄組中環(huán)境脅迫響應(yīng)成分,能量代謝成分,對(duì)光反

3、應(yīng)成分等顯著富集,而與生長(zhǎng)發(fā)育過程相關(guān)的組分則缺乏。通過這個(gè)研究,我們?cè)讷@悉表達(dá)譜的同時(shí)得到了角果木和旁杞木大量EST序列,為這兩個(gè)物種及近緣物種的群體遺傳學(xué),物種形成,以及功能基因組學(xué)研究的開展奠定了基礎(chǔ),同時(shí)也為Solexa測(cè)序技術(shù)在高等非模式植物中的應(yīng)用提供了一個(gè)借鑒。
　　 我們使用實(shí)時(shí)定量PCR驗(yàn)證了一批受鹽誘導(dǎo)的紅樹功能基因,結(jié)合RACE及染色體步移技術(shù),獲得了P5CS,NHX,CDPK,CIPK,WRKY等一批基因

4、的全長(zhǎng)或近全長(zhǎng)cDNA,及部分基因的5'調(diào)控區(qū)序列。與對(duì)鹽敏感的擬南芥同源基因比較顯示,紅樹抗鹽基因在蛋白水平并沒有表現(xiàn)出更高效力的抗鹽能力,但是在表達(dá)調(diào)控上顯示了“顯著”的差異。紅樹耐鹽基因表現(xiàn)出更強(qiáng)的組織特異性,擬南芥NHX1基因在植物各個(gè)器官都比較均衡的表達(dá),紅樹植物桐花樹NHX1只是在葉中強(qiáng)烈表達(dá),這可能與桐花樹的泌鹽機(jī)制密切相關(guān),這種特化可能是紅樹適應(yīng)鹽生環(huán)境的重要方面。
　　 紅樹鹽誘導(dǎo)基因不僅是一種重要的遺傳資源,

5、而且為在分子水平檢驗(yàn)自然選擇提供了一個(gè)極好的材料,鹽耐受基因的群體遺傳和進(jìn)化分析將為我們了解各種進(jìn)化動(dòng)力在紅樹鹽適應(yīng)形成過程的作用提供重要信息。首先,為衡量基因組水平桐花樹的遺傳多樣性及遺傳結(jié)構(gòu),我們采集世界范圍的13個(gè)桐花樹種群共計(jì)202個(gè)個(gè)體用AFLP分子標(biāo)記進(jìn)行了基因組掃描,結(jié)果顯示桐花樹具有較高的遺傳多樣性(P=92％,HE=0.294,HS=0.331),同時(shí)種群間存在巨大的遺傳分化(GST=0.698)。在此基礎(chǔ)上,我們選取

6、了中國(guó)、泰國(guó)、斯里蘭卡和澳大利亞的八個(gè)代表性種群,對(duì)四個(gè)受鹽激顯著上調(diào)的表達(dá)基因:AcP5CS、AcNHD、AcNHX2和AceIF3B進(jìn)行了群體遺傳和分子進(jìn)化分析。四個(gè)基因表現(xiàn)了不同的進(jìn)化模式,雖然地理隔離和群體的進(jìn)化歷史可以部分解釋這些現(xiàn)象,各地的生態(tài)環(huán)境因素可能也發(fā)揮了極重要的作用。地理隔離和群體歷史對(duì)于整個(gè)基因組的影響是相似的,我們檢測(cè)到的不一致提示自然選擇等因素在其中起了一定的作用,這需要選取更多的基因位點(diǎn)進(jìn)一步研究。

7、　　 siRNA介導(dǎo)的基因沉默及異染色質(zhì)形成在保持基因組完整性中發(fā)揮著重要的作用,此過程中雙鏈RNA的形成是關(guān)鍵,除少部分位點(diǎn)具有反向重復(fù)結(jié)構(gòu)及轉(zhuǎn)錄本有重疊的基因?qū)梢宰匀恍纬呻p鏈外,擬南芥中主要通過RDR2(RNAdependent RNA polymerase2)來完成雙鏈RNA的合成。
　　 用RDR2作誘餌經(jīng)酵母雙雜交篩選我們得到一個(gè)相互作用蛋白AtJMJ24,初步分析AtJMJ24具有RING和JmjC兩個(gè)功能域。通

8、過詳實(shí)的生化實(shí)驗(yàn)我們證實(shí)AtJMJ24與RDR2在體內(nèi)體外都有相互作用,而且在體內(nèi)體外都可以泛素化RDR2,該泛素化極可能是單泛素化,而且在體內(nèi)JMJ24泛素化RDR2可以穩(wěn)定RDR2,我們進(jìn)一步用蛋白質(zhì)質(zhì)譜技術(shù)確定了一個(gè)泛素化位點(diǎn)。同時(shí)我們還證實(shí)AtJMJ24具有H3K9me2去甲基化活性,對(duì)于沉默位點(diǎn)基礎(chǔ)量轉(zhuǎn)錄本的產(chǎn)生是必需的,通過對(duì)jmj24與rdr2雙突變體的分析,我們確定兩者作用在同一信號(hào)通路中,JMJ24作用于RDR2的上游