雄烯二酮生產(chǎn)菌耐底物及高產(chǎn)性的比較基因組學(xué)分析.pdf

1、雄烯二酮（androst-4-ene-3,17-dione, AD）是甾體激素藥物生成過程中不可缺少的中間體，幾乎所有的甾體激素藥物都是以其作為起始原料進(jìn)行生產(chǎn)的。目前在全世界范圍內(nèi)，AD做原材料生產(chǎn)的醫(yī)藥品種不斷增加，為世界上的廣大患者帶來了福音。目前AD的制備方法主要有化學(xué)合成法與微生物轉(zhuǎn)化法。由于微生物轉(zhuǎn)化法具有反應(yīng)條件溫和、周期短、高效、環(huán)境友好等特點(diǎn)故被廣泛應(yīng)用。
　　本研究以實(shí)驗(yàn)室前期通過誘變獲得的一株能在較高濃度底物

2、下生長且轉(zhuǎn)化能力較出發(fā)菌株提高的突變株新金分枝桿菌MN4及出發(fā)菌株MN2為研究對象，通過Illumina高通量測序技術(shù)對相關(guān)菌株的全基因組和轉(zhuǎn)錄組等進(jìn)行分析，研究新金分枝桿菌MN4高產(chǎn)及耐底物機(jī)制，以期為深入研究兩株菌的遺傳背景信息、甾醇降解生產(chǎn)AD機(jī)制以及耐底物高產(chǎn)機(jī)制、分子育種等奠定基礎(chǔ)。本研究結(jié)果如下：
　　1.新金分枝桿菌（Mycobacterium neoaurum）MN2與MN4全基因組測序及功能注釋
　　采用

3、Illumina Hiseq2500測序平臺，對 Mycobacterium neoaurum MN2與Mycobacterium neoaurum MN4進(jìn)行全基因組測序，測序分別獲得14 Mb和8.1 Mb的原始數(shù)據(jù)，采用Velvet軟件對測序獲得的序列進(jìn)行從頭組裝得到43個和33個Contigs?；蚪M序列提交NCBI數(shù)據(jù)庫，登錄號分別為JXYZ00000000和LQMX00000000。Mycobacterium neoauru

4、m MN2與 Mycobacterium neoaurum MN4的基因組大小為5,390,529bp、5,421,27bp, GC含量都為66.9%。Mycobacterium neoaurum MN2與共編碼4890個CDS，46個tRNA和6個rRNA操縱子；Mycobacterium neoaurum MN4共編碼4920個CDS，46個tRNA和6個rRNA操縱子。
　　2. Mycobacterium neoaurum

5、 MN2與MN4比較基因組分析
　　基因組的序列分析主要包括：COG注釋、 GO注釋，次級代謝產(chǎn)物分析、變異檢測，以及植物甾醇降解相關(guān)基因分析等。通過將所有的基因編碼的蛋白序列與COG數(shù)據(jù)庫和InterProScan數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，然后按照分類標(biāo)準(zhǔn)將蛋白進(jìn)行分類，結(jié)果顯示大量株菌中存在的基因集中于代謝、轉(zhuǎn)錄、生物合成等過程，表明菌株代謝活動較為活躍。通過 KEGG注釋以及比較分析的方法重建了兩株菌的各個代謝途徑，著重分析了甾醇降解

6、途徑涉及到的關(guān)鍵基因。
　　使用GATK與SAMTOOLS軟件將MN4基因組的reads mapping到MN2的基因組中進(jìn)行變異檢測，共發(fā)現(xiàn)184個突變；發(fā)現(xiàn)與甾體母核降解的相關(guān)基因膽固醇氧化酶ChoM1及側(cè)鏈?氧化過程中FadE family、FadB family、FadAfamily等基因發(fā)生突變。
　　3. Mycobacterium neoaurum MN2與MN4比較轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析
　　比較轉(zhuǎn)錄組的分析主要

7、包括：表達(dá)差異量的計(jì)算、差異表達(dá)基因GO富集、差異表達(dá)基因 KEGG富集。使用 Bowtie2將干凈數(shù)據(jù) mapping到參考基因上(MN2)，采用 Cufflink軟件進(jìn)行表達(dá)量的差異計(jì)算，共發(fā)現(xiàn)51個差異基因，其41個基因上調(diào)，10個基因下調(diào)，其中與甾醇降解途徑相關(guān)基因CYP125A1上調(diào)。這些差異基因主要顯著富集在糖代謝，脂質(zhì)代謝，氨基酸代謝、能量代謝過程以及植物甾醇代謝途徑。
　　本研究對雄烯二酮生成菌株Mycobacte