小尾寒羊5個(gè)與繁殖和疾病抗性相關(guān)基因的克隆及比較基因組學(xué)分析.pdf

1、綿羊作為世界上重要的可再生資源,在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中占有重要的地位.在雞、牛和豬已經(jīng)完成初步的基因組測(cè)序的情況下,綿羊基因組的研究現(xiàn)狀呈現(xiàn)明顯的滯后狀態(tài).基于比較基因組學(xué)的研究手段,在基因組圖譜和測(cè)序的基礎(chǔ)上,利用模式生物基因組研究中獲得的信息推測(cè)畜禽品種中的基因數(shù)目、位置、功能、表達(dá)機(jī)理和物種進(jìn)化,可以實(shí)現(xiàn)對(duì)畜禽品種重要經(jīng)濟(jì)性狀候選基因的鑒定、克隆和特性的認(rèn)識(shí).本課題嘗試在中國(guó)地方綿羊品種的功能基因組研究中引入比較基因組的研究方法,進(jìn)行綿羊繁

2、殖和疾病抗性相關(guān)基因的克隆,為中國(guó)地方綿羊的選育和品種資源保護(hù)提供理論依據(jù),并用以指導(dǎo)綿羊品種的分子育種和品種資源的保護(hù)工作. 本實(shí)驗(yàn)共克隆了綿羊YB-1、綿羊和山羊ISGl5、TLR9、MSY2和CIBl5個(gè)基因,并對(duì)各個(gè)基因進(jìn)行了比較基因組學(xué)分析,結(jié)果如下: 綿羊YB-1 mRNA全長(zhǎng)1449bp(GenBankNo.EF488163),ORF為867核苷酸,可編碼288個(gè)氨基酸,該蛋白具有典型的CSD結(jié)構(gòu)域,氨基酸序列與人

3、、犬、小鼠、大鼠、黑猩猩、恒河猴等的一致性均在95﹪以上.綿羊YB-1,為無(wú)TATA盒的啟動(dòng)子,5'-UTR分布有GATA-1、GATA-2、GATA-3和AML-1a轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點(diǎn).多物種的YB-1 5'-UTR.的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)分析表明,YB-1基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)調(diào)控的復(fù)雜性與物種進(jìn)化復(fù)雜程度可能存在一定的相關(guān)性.43個(gè)物種YB-1及其直向同源物蛋白的聚類與生物進(jìn)化的方向基本一致,并且蛋白的3-D結(jié)構(gòu)也同樣保守,但各物種YB-1的非

4、翻譯區(qū)在基因調(diào)控及表達(dá)中發(fā)揮了不同作用,從而在進(jìn)化方向上存在一定差異. 建立了高效的綿羊YB-1原核表達(dá)體系,為進(jìn)一步獲得抗血清并應(yīng)用到Y(jié)B-1蛋白功能研究奠定了基礎(chǔ). 小尾寒羊睪丸和卵巢中共克隆了75個(gè)非冗余的YB-1選擇性剪接產(chǎn)物克隆,其中卵巢組織中26個(gè),睪丸組織中49個(gè),涵蓋了5'端或3'端的選擇性剪接、外顯子跳躍及內(nèi)含子保留等3種主要的剪接方式.其中34條編碼的氨基酸殘基超過(guò)20個(gè),根據(jù)編碼產(chǎn)物blastp分析

5、的結(jié)果可將其分為6組.第一組共10個(gè)選擇性剪接產(chǎn)物(卵巢中1個(gè),睪丸中9個(gè)),編碼蛋白均為YB-1長(zhǎng)度不等的C端結(jié)構(gòu)域.第二組共計(jì)17個(gè)(卵巢中4個(gè),睪丸中13個(gè))與犬中存在的另一種YB-1選擇性剪接的蛋白序列一致性達(dá)到94﹪.第三組共3條序列,第四組共2條序列,均為睪丸中的選擇性剪接產(chǎn)物,功能未知.第五組序列為1條,12個(gè)AA與多物種YB,1的C段結(jié)構(gòu)域存在85﹪的一致性.第六組序列為卵巢中的1條選擇性剪接方式,功能未知.綿羊YB-1

6、基因在不同生殖系統(tǒng)中可能存在大量的非編碼mRNA,睪丸非編碼mRNA為42﹪(21/49),卵巢的非編碼mRNA為84﹪(22/26).7條150bp以下的YB-1擴(kuò)增產(chǎn)物的RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)呈現(xiàn)一種類似的"莖泡"樣結(jié)構(gòu),并隨著序列堿基數(shù)目增加在主莖環(huán)結(jié)構(gòu)外也增加了其他莖環(huán)結(jié)構(gòu),使整體的二級(jí)結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)"十字"型變化. 小尾寒羊和濟(jì)寧青山羊ISG15 DNA全長(zhǎng)分別為1033bp和911bp,均由兩個(gè)外顯子構(gòu)成.綿羊ISG15mRN

7、A序列與其他物種的相似性分別為,牛94﹪、黑猩猩77﹪、人77﹪、恒河猴77﹪、小鼠77﹪.蛋白的相似性分別為牛87﹪、黑猩猩66﹪、人66﹪、恒河猴67﹪、小鼠63﹪.多物種的ISGl5蛋白均存在2個(gè)泛素同源結(jié)構(gòu)域,并且其3-D結(jié)構(gòu)也顯示出較高的相似性.已克隆的小尾寒羊序列在904bp出現(xiàn)1個(gè)G的插入突變,13bp后又出現(xiàn)了1個(gè)G的缺失突變,由此造成小尾寒羊ORF框ORF從GellBaIlk綿羊ISGl5mRNA參照序列(NM-001

8、009735.1)的474bp延長(zhǎng)至55525bp,編碼氨基酸殘基的個(gè)數(shù)也從GenBank的參照序YlJNP 001009735.1的157個(gè)氨基酸殘基變?yōu)?74個(gè)氨基酸殘基,3'-UTR也相應(yīng)地縮短為19bp.濟(jì)寧青山羊的ISGl5 ORF為402bp,編碼133個(gè)氨基酸殘基.ISGl5的啟動(dòng)子區(qū)分析顯示該基因?yàn)闊o(wú)TATA盒啟動(dòng)子,除犬DPE出現(xiàn)于mRNA的+4l～+45bp外,多物種ISGl5的DPE均以(GTGA)AGATG的形式

9、出現(xiàn)于+23～+27.小尾寒羊和濟(jì)寧青山羊的DNA預(yù)測(cè)出的蛋白由于DNA序列中存在的堿基插入或(和)缺失的現(xiàn)象,使其ISGl5蛋白C末端結(jié)構(gòu)并不存在Lcu-Arg-Lcu-Arg-Gly.Gly(LRLRGG)序列. 綿羊基因組中TLR9以單拷貝形式出現(xiàn),基因克隆產(chǎn)物長(zhǎng)4192 bp,包括115 bp的5,-UTR、2個(gè)Exon和44bp的3'-UTR.小尾寒羊TLR9經(jīng)基因預(yù)測(cè)后,與其他哺乳動(dòng)物TLR9mRNA的相似性分別為,

10、牛96﹪,豬87﹪,馬86﹪,貓85﹪,犬85﹪,人83﹪,黑猩猩83﹪,恒河猴83﹪,大鼠78﹪,小鼠77﹪,和負(fù)鼠70﹪.TLR9蛋白與其他各物種的相似性分別為,牛95﹪,豬85﹪,馬83﹪,貓84﹪,犬83﹪,人79﹪,黑猩猩79﹪,恒河猴79﹪,大鼠72﹪,小鼠73﹪,和負(fù)鼠60﹪.多物~TLR9蛋白功能域在數(shù)量、種類及相對(duì)位置上均有不同,因而造成恒河猴和小鼠在多物種TLR9蛋白功能域聚類分析與基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹的聚類的位置上存在

11、差異. 綿羊基因組中MSY2以單拷貝形式出現(xiàn),基因克隆產(chǎn)物長(zhǎng):4927 bp,包括外顯子2～8和493 bp的3'-UTR,在綿羊的精子和卵子發(fā)生過(guò)程中,MSY2可能在基因轉(zhuǎn)錄、RNA穩(wěn)定性和RNA的翻譯調(diào)控中發(fā)揮重要作用. CIBl基因組擴(kuò)增產(chǎn)物為3Kb,包括7個(gè)外顯子及50bp的5'-UTR和189bp的3'-UTR.CIBl睪丸cDNA擴(kuò)增產(chǎn)物799 bp,ORF為576bp,編碼191個(gè)氨基酸.多物種CIBl非常