水稻條斑病菌致病相關(guān)基因的鑒定與功能研究.pdf

1、水稻條斑病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzicola，Xoc)是水稻黃單胞菌(Xanthomonas oryzae)種下兩致病變種之一，引起水稻細菌性條斑病(Bacterial LeafStreak，簡稱條斑病，BLS)。近年來該病發(fā)生日趨嚴重，成為水稻上第四大病害。該病原菌從氣孔或傷口侵入，在薄壁細胞間繁殖與危害，因受葉脈限制產(chǎn)生條斑病癥狀。由于感病雜交水稻大面積推廣，且生產(chǎn)上無有效的抗條斑病種質(zhì)資源，水稻安全

2、生產(chǎn)受到嚴重的威脅。近年來，X.oryzae pv.oryzicola大量致病性相關(guān)基因(如hrp、avr、rpf及其它毒性候選基因等)的研究揭示，毒性相關(guān)基因的鑒別是全面解析病原菌致病機理以及發(fā)展高效生物防治的基礎(chǔ)。
　　 目前，構(gòu)建植物病原菌突變體庫是挖掘新基因和進行功能基因組學研究的有效途徑。因此，為了從全基因組范圍內(nèi)挖掘X.oryzae pv.oryzicola致病性相關(guān)因子，本研究以RS105為出發(fā)菌株，構(gòu)建了一個包含

3、25，000突變子的X.oryzae pv.oryzicola Tn5轉(zhuǎn)座子插入突變體庫，約5×ORF于基因組(約4，600個ORF)的覆蓋量。Southern Blot分析表明，Tn5插入突變體庫是穩(wěn)定的、隨機的。將每個突變子分別接種感病寄主水稻(cv.Shanyou63)，經(jīng)第一輪篩選共獲得了1，753個致病性完全喪失或毒性減弱的突變體。為了進一步驗證其在水稻上的致病表型，經(jīng)第二輪篩選，共獲得了114個致病性完全喪失或毒性顯著減弱的

4、突變體，其中致病性完全喪失的14個。隨后，將114個致病性完全喪失或毒性顯著減弱的突變體分別接種非寄主煙草(cv.Xanthi)，共獲得23個過敏性反應(hypersensitive response，HR)喪失或明顯減弱的突變體，其中HR完全喪失的15個。以上突變體的獲得，為分析X.oryzae pv.oryzicola致病性相關(guān)基因提供了材料基礎(chǔ)。
　　 為了快速準確地確定Tn5插入的位點和具體功能基因，本研究采用熱不對稱交

5、錯PCR(TAIL-PCR)技術(shù)對114個致病性完全喪失或顯著減弱的突變體進行了鑒別。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)座子Tn5插入在致病性相關(guān)基因上，包括hrp、avr、rpf、 wxoc、代謝相關(guān)基因、conserved hypothetical protein及其它毒性基因等。大批致病相關(guān)基因的發(fā)現(xiàn)，不僅為從分子水平上解析X.oryzae pv.oryzicola的致病機理，而且對于揭示植物-病原物互作的致病性和抗病性，具有全局性的科學價值。

6、　　 關(guān)鍵毒性基因的功能鑒定是理解X.oryzae pv.oryzicola致病機理的先決條件。為此，對27個在水稻上完全喪失致病性或毒性顯著減弱的突變體進行了分析。其中14個突變體完全喪失在水稻上的致病性和在煙草上激發(fā)過敏性反應(hypersensitiveresponse，HR)的能力(表型為Pth-/HR-);另外13個突變體全毒性顯著減弱，但仍具有在煙草上激發(fā)HR的能力(Vir-/HR+)。Tn5插入基因序列分析揭示，14個P

7、th-/HR-突變體是Tn5插入在以下基因上:hrcC(2個)、hrcT、hrcV(4個)、hpaP、hrcQ(2個)、hrpF、hrpG和hrpX(2個);13個Vir-/HR+突變體被Tn5插入的基因分別是:tal-C(l)0c-like(TAL效應分子)、rpfC(致病性調(diào)控子)、oxyP(過氧化壓力調(diào)控子)、dsbC(二硫化合物異構(gòu)酶)、opgH(葡聚糖生物合成葡(萄)糖基轉(zhuǎn)移酶H)、rfbA(1-磷酸葡萄糖乙酰基轉(zhuǎn)移酶)、am

8、tR(氨基轉(zhuǎn)移酶)、purF(氨基磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶)、thrC(蘇氨酸合成酶)、trpA(色氨酸合成酶a亞基)和3個功能未知蛋白的基因Xoryp_02235、 Xoryp_00885和Xoryp_22910。即這27個突變體是Tn5插入在21個不同的ORFs上。此外上述13個全毒性減弱的突變體，功能互補都能恢復至野生型水平，這表明amtR、purF、thrC、trpA、Xoryp_02235、Xoryp_00885扣Xoryp_22910

9、是參與X.oryzae pv.oryzicola全毒性的新基因，未見在其它植物病原細菌中報道。Real-time PCR證明，上述7個新毒性基因在植物中是受誘導表達的，但是它們在參與X.oryzae pv.oryzicola致病機理上的詳細功能，仍需進一步的研究。
　　 植物病原細菌與寄主互作的一個重要方面是病原菌在植物組織內(nèi)獲取營養(yǎng)的能力。碳水化合物的獲取對于病原菌在寄主植物中生長繁殖、成功建立營養(yǎng)寄生關(guān)系至關(guān)重要。盡管代謝途

10、徑一般不認為是毒性因子，但是闡述碳水化合物獲取與代謝的詳細機制對于全面理解X.oryzae pv.oryzicola的寄生性和致病性具有重要科學意義。
　　 果糖-1，6-二磷酸醛縮酶(FbaB)，是有機生物體糖酵解和糖異生途徑中的一個重要代謝酶。X.oryzae pv.oryzicola基因組中唯一的fbaB基因突變，不僅導致病原菌喪失利用丙酮酸和蘋果酸進行生長的能力，也延緩其利用果糖作為唯一碳源時的生長;而且也降低了胞外多糖

11、(EPS)的產(chǎn)量及降低了細菌在水稻上毒性和生長。經(jīng)序列分析發(fā)現(xiàn)fbaB啟動子區(qū)含有一個不完全的PIP-box(Plant-inducible promoter,TTCGT-N9-TTCGT)。有意義的是，fbaB的表達受hrp調(diào)控子HrpG和HrpX的負調(diào)控，且PIP-box堿基置換改變了它們對fbaB的調(diào)控。Real-time PCR結(jié)果顯示，RS105菌株中的fbaB在植物中是受誘導表達的;而且fbaB缺失抑制了hrpG和hrpX的

12、表達，hrcC、 hrpE和hpa3的轉(zhuǎn)錄反而增強，對其余的hrp-hrc-hpa基因表達沒有影響。而碳源利用能力測定揭示，hrcC、hrpE和hpa3突變體相應減弱了病原菌利用丙酮酸和蘋果酸的能力。另外，fbaB突變體在植物上的毒性和生長以及EPS的產(chǎn)量，功能互補能夠完全恢復至野生型水平。這是第一次報道表明，X.oryzae pv.oryzicola吸收的碳水化合物在fbaB基因位點通過一個未知因子在調(diào)節(jié)hrp基因的表達上扮演著重要作

13、用。
　　 另外，對X.oryzae pv.oryzicola全基因組搜索發(fā)現(xiàn)了兩個編碼6-磷酸葡萄糖脫氫酶的基因，催化6-磷酸葡萄糖轉(zhuǎn)化成6-磷酸葡萄糖酸，在2-酮-3-脫氧-6-磷酸葡糖酸裂解途徑(ED途徑)與磷酸戊糖途徑中發(fā)揮著重要作用。為了明確這兩個基因的功能，本研究對X.oryzae pv.oryzicola中起主導作用的zwf(Xoryp_12765)基因進行了缺失突變。結(jié)果顯示，zwf突變后，病原菌利用葡萄糖、果糖

14、、蔗糖、甘露糖和半乳糖的能力顯著降低，但不影響其利用丙酮酸或蘋果酸的能力。這表明，zwf突變可能阻礙了磷酸戊糖途徑和ED途徑，但不影響糖異生途徑。同時也發(fā)現(xiàn)zwf是受誘導表達的，相對于無糖條件下的，葡萄糖、蔗糖、果糖、甘露糖及半乳糖均顯著增強zwf的轉(zhuǎn)錄水平達3倍以上。有趣的是，zwf突變導致DSF信號通路關(guān)鍵基因如rpfF、rpfG、clp基因的轉(zhuǎn)錄表達發(fā)生改變，這暗示，zwf可能參與對DSF下游某些毒性因子的調(diào)控。此外，zwf突變，

15、X.oryzae pv.oryzicola胞外蛋白水解酶活性增強，胞外多糖的產(chǎn)量降低、游動性及水稻上的毒性減弱。經(jīng)功能互補能夠完全恢復至野生型水平。這些結(jié)果說明，zwf是X.oryzae pv.oryzicola全毒性所需的。
　　 6-磷酸葡萄糖異構(gòu)酶在碳水化合物代謝中具有重要作用，可逆的催化6-磷酸葡萄糖轉(zhuǎn)化成6-磷酸果糖。Xoryp_10540(pgi)是X.oryzae pv.oryzicola全基因組中6-磷酸葡糖異構(gòu)

16、酶唯一編碼基因。實驗表明，pgi突變致使病原菌不能有效利用果糖、蔗糖、甘露糖、丙酮酸，但是不影響其在葡萄糖或半乳糖作為唯一碳源的培養(yǎng)基上生長。值得一提的是，pgi突變導致DSF信號通路關(guān)鍵基因rpfF、 rpfG、clp基因的轉(zhuǎn)錄表達發(fā)生顯著改變。DSF信號檢測顯示，pgi突變體產(chǎn)生的DSF信號較野生型RS105水平明顯減弱。這些結(jié)果提示，pgi突變可能對DSF信號調(diào)控網(wǎng)絡(luò)下游基因的表達有一定的影響。同樣地，pgi突變降低了病原菌的胞外

17、多糖(EPS)的產(chǎn)量、游動性，并減弱病原菌在水稻上的毒性。功能互補能夠完全恢復至野生型水平。這些結(jié)果說明，pgi是X.oryzae pv.oryzicola EPS產(chǎn)生和全毒性所需的。
　　 水稻白葉枯病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzae，Xoo)是水稻黃單胞菌(Xanthomonas oryzae)種下另一致病變種，通過T3SS將各類效應蛋白注入寄主植物細胞內(nèi)，引起水稻白葉枯病(bacterial b

18、light，BB)，是水稻上三大病害之一。病原菌通過葉尖和葉緣上的水孔侵入水稻葉片，定殖于維管束中并在木質(zhì)部進行傳播。依據(jù)本實驗室基因芯片數(shù)據(jù)，篩選獲得一個參與X.oryzae pv.oryzae能量代謝的基因，PXO_03531(ketoglutarate transport protein，kgtP)。該基因在hrpX或hrpG突變體中的表達顯著下調(diào)。分析發(fā)現(xiàn)，kgtP啟動子區(qū)存在一個不完全的PIP-box(TTCGA-N21-TT

19、CGC)，且其編碼產(chǎn)物KgtP的N端前50個氨基酸具有典型的Ⅲ型分泌信號。這提示，X.oryzae pv.oryzae kgtP可能是HrpX的調(diào)節(jié)子及T3SS效應分子。RT-PCR實驗證實，HrpX和HrpG正調(diào)控kgtP的表達。免疫雜交結(jié)果顯示，KgtP依賴T3SS，但不依賴于T3S出口控制蛋白HpaB進行分泌。細胞定位結(jié)果顯示KgtP定位在細胞膜上，推測其結(jié)合到植物細胞膜上從而有利于從植物體內(nèi)獲取α-酮戊二酸。kgtP缺失突變，減

20、弱了病原菌在植物上的生長與毒性，且細菌不能在含有α-酮戊二酸或琥珀酸鈉為唯一碳源的基本培養(yǎng)基上生長，功能互補能有效恢復至野生型水平。RT-PCR結(jié)果顯示，X.oryzae pv.oryzae在加入α-酮戊二酸為唯一碳源的基本培養(yǎng)基或與水稻懸浮細胞互作，kgtP的表達受到顯著誘導，表明kgtP是受誘導表達的。有趣的是，kgtP缺失突變可以導致水稻上合成α-酮戊二酸的異檸檬酸脫氫酶基因表達明顯下降。據(jù)此推測，在腐生狀態(tài)下，X.oryzae