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文檔簡介
1、本研究目的是用條斑紫菜6-磷酸海藻糖合成酶基因(PyTPS)轉(zhuǎn)化水稻獲得轉(zhuǎn)基因植株,為篩選出耐鹽、抗旱的轉(zhuǎn)基因水稻植株與品系奠定基礎(chǔ),主要研究結(jié)果如下:
1、建立了水稻成熟胚愈傷組織為外植體的再生體系。
日本晴、臺北309、中花11、旱稻297四個品種的種子在N6+2,4-D2mg/L+CH0.3g/L+脯氨酸2.878g/L培養(yǎng)基上可誘導(dǎo)出淡黃色顆粒狀、結(jié)構(gòu)致密的愈傷,愈傷在RGH6培養(yǎng)基上可分化出不定芽,
2、分化率分別為78.8%,80.0%,70.6%和84.0%。在1/2MS+MET2mg/L培養(yǎng)基上可順利生根,形成完整的植株。
2、建立了農(nóng)桿菌介導(dǎo)的水稻遺傳轉(zhuǎn)化體系,獲得了抗卡那霉素的再生植株。
在含卡那霉素、利福平與氯霉素三種抗生素的培養(yǎng)基上對農(nóng)桿菌株AGL1(pCAMBIA2300-PyTPS)進(jìn)行了嚴(yán)格的活化培養(yǎng)。利用針對目的基因的DNA引物(R1和3KpnI)、針對載體與目的基因的引物(35Sfor
3、和P4)及針對NPTⅡ基因的引物(NPTⅡ-F和NPTⅡ-R)對PyTPS基因的植物表達(dá)載體進(jìn)行了PCR鑒定,并分別擴(kuò)增出了1300bp、500bp與600bp的特異性片段.
用100μmol/L乙酰丁香酮制備農(nóng)桿菌懸浮液,成熟胚誘導(dǎo)的愈傷繼代培養(yǎng)一周后,經(jīng)過農(nóng)桿菌懸浮液侵染20min,28℃黑暗中共培養(yǎng)3d,然后將愈傷組織接在篩選培養(yǎng)基上(N6+2,4-D2mg/L+麥芽糖20mmg/L+甘露醇36.43mg/L+Cef
4、400mg/L+Km100mg/L+瓊脂粉8.0g/LpH5.8),28℃暗培養(yǎng)20~25d后,進(jìn)行第一次篩選。進(jìn)行第二次篩選的培養(yǎng)基提高了卡那霉素濃度(N6+2,4-D2mg/L+麥芽糖20mmg/L+甘露醇36.43mg/L+Cef400mg/L+Km150mmg/L+瓊脂粉8.0g/LpH5.8)。大部分愈傷組織在篩選10d左右開始褐化,然后在褐化組織的邊緣選取重新長出乳白色愈傷抗性組織。
經(jīng)2~3輪篩選后長出的抗性
5、愈傷組織中挑選乳黃色致密性好的抗性愈傷組織轉(zhuǎn)至28℃,16h/d光照條件下的分化培養(yǎng)基上,一般經(jīng)過20d,有綠點(diǎn)出現(xiàn),30~40d后進(jìn)一步分化出小芽。當(dāng)小芽長至約1cm時,移到生根培養(yǎng)基上,形成完整的植株。
3、建立了PCR擴(kuò)增與鑒定體系,篩選出了水稻轉(zhuǎn)基因植株。
用CTAB法提取水稻抗性植株與非轉(zhuǎn)基因植株的DNA,并用作模板,用持家基因的引物PT1、PT2進(jìn)行PCR擴(kuò)增,均獲得了350bp的目的條帶,也就是
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