條斑紫菜的轉(zhuǎn)基因研究.pdf

1、純系培育是傳統(tǒng)紫菜育種及進(jìn)行紫菜生物工程研究的先決條件.該研究選取青島地區(qū)野生條斑紫菜(Porphyra yezoensis),利用酶解制備原生質(zhì)體進(jìn)行再培養(yǎng)的方法培育了營養(yǎng)體純系PY-qingdaol.對PY-qingdaol的18S rRNA基因進(jìn)行了克隆和序列測定.將該基因與從GenBank獲得的22個(gè)紫菜進(jìn)行了分析、比較,并以相鄰連接法構(gòu)建了紫菜較為一致的系統(tǒng)發(fā)生樹.結(jié)果表明利用紫菜18S rDNA基因序列差異可較精確的進(jìn)行紫菜

2、種間乃至品系的劃分,這為進(jìn)行紫菜的種質(zhì)鑒定提供了一個(gè)新的思路.為確立電擊法轉(zhuǎn)化條斑紫菜原生質(zhì)體的條件、確定有效的啟動子并驗(yàn)證以18S rDNA為外源基因整合位點(diǎn)的可行性,構(gòu)建了以條斑紫菜18S rDNA片段為同源臂、CaMV35S為啟動子、GUS基因?yàn)閳?bào)告基因的同源重組型表達(dá)載體,并利用電擊法對外源GUS基因在條斑紫菜原生質(zhì)體瞬間表達(dá)進(jìn)行了初步探索.為確定合適的選擇性標(biāo)記基因,以條斑紫菜18S rDNA片段為同源臂,構(gòu)建了分別利用SV4

3、0啟動子和CaMV35S啟動子的兩種cat基因的同源重組型表達(dá)載體pQD-CAT-control和pQD-CAT-Enhancer.利用電擊法將所構(gòu)建的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化條斑紫菜原生質(zhì)體.結(jié)果表明,SV40啟動子和CaMV35S啟動子均可以驅(qū)動cat基因在條斑紫菜原生質(zhì)體中有效表達(dá);所構(gòu)建的以18S rDNA片段為同源臂的兩種同源重組型載體均可實(shí)現(xiàn)cat基因在條斑紫菜原生質(zhì)體中的穩(wěn)定表達(dá);當(dāng)以cat基因作為選擇性標(biāo)記基因時(shí),氯霉素可以作為紫菜

4、原生質(zhì)體基因轉(zhuǎn)化的選擇壓力.對小鼠的TRAIL cDNA,進(jìn)行了克隆和序列測定,并構(gòu)建了以條斑紫菜18S rDNA片段為同源臂、cat基因?yàn)闃?biāo)記基因、TRAIL基因?yàn)橥庠椿?、分別利用SV40啟動子和CaMV35S啟動子的同源重組型表達(dá)載體pQD-TRAIL-CAT.利用電擊法將其轉(zhuǎn)化條斑紫菜原生質(zhì)體,經(jīng)氯霉素初步篩選,檢測到外源基因已整合到紫菜基因組中.進(jìn)行了條斑紫菜原生質(zhì)體的玻璃化冷凍保存研究,發(fā)現(xiàn)玻璃化保護(hù)劑VS6(10﹪ DMS

5、O,30﹪甘油,10﹪蔗糖)的保存效果較好,其最佳凍存程序是:25﹪ VS6過渡處理5min后,用0℃預(yù)冷的VS6處理3min,直接液氮保存,化凍時(shí)采用40℃水浴快速化凍.按此方法,冷存后的原生質(zhì)體的存活率可達(dá)66.5﹪,并且能再生成葉狀體.總之,該研究初步建立了條斑紫菜原生質(zhì)體的轉(zhuǎn)基因體系,優(yōu)化了電擊法轉(zhuǎn)化條斑紫菜原生質(zhì)體的條件,確定了SV40啟動子和CaMV35S啟動子為有效的啟動子,cat基因可以作為選擇性標(biāo)記基因,以18S rD