甜瓜細(xì)菌性果斑病菌Ha17A致病相關(guān)基因的克隆.pdf

1、甜瓜細(xì)菌性果斑病病原菌為燕麥?zhǔn)乘峋捁蟻喎N[Acidovorax avenae subsp.citrulli]，該病害對(duì)許多國家和地區(qū)西瓜和厚皮甜瓜的生產(chǎn)造成了嚴(yán)重危害。目前，對(duì)甜瓜細(xì)菌性果斑病的研究多側(cè)重于檢測和鑒定，然而對(duì)其病原物致病性分子機(jī)制的研究卻鮮有報(bào)道。本研究對(duì)燕麥?zhǔn)乘峋鞴蟻喎NHa17A菌株的致病相關(guān)基因進(jìn)行了初步的研究。 首先，針對(duì)燕麥?zhǔn)乘峋鞴蟻喎N的致病性特點(diǎn)，建立了一套便捷的篩選燕麥?zhǔn)乘峋鞴蟻喎N突變菌株篩選

2、體系——離體葉片篩選法。根據(jù)已發(fā)表的A.avenae subsp.citrulli AAC00-1基因組序列設(shè)計(jì)引物hrcV26303和hrcV27493擴(kuò)增type Ⅲ分泌系統(tǒng)保守基因hrcV的部分序列，構(gòu)建自殺載體pSR47s-hrcV，定位突變Ha17A菌株的hrcV基因，獲得致病性完全喪失的突變菌株17A-hrcV。用離體葉片篩選法對(duì)17A-hrcV突變菌株進(jìn)行致病性測定，結(jié)果顯示hrcV基因的突變菌株完全喪失了致病性，證明ty

3、peⅢ系統(tǒng)在Ha17A的致病性中具有重要作用，同時(shí)也確認(rèn)了篩選體系的合理性。 其次，利用三親雜交的方法將帶有抗卡那霉素標(biāo)記的Tn5轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)入甜瓜果斑病菌Ha17A的細(xì)胞中，Tn5隨機(jī)插入到Ha17A基因組DNA上，獲得大量的突變菌株；利用離體葉片篩選法，從600個(gè)突變菌株中篩選到3個(gè)致病性明顯減弱的突變菌株D33、B17和F8。 另外，通過“鳥槍法”克隆到兩個(gè)突變菌株D33和B17的Tn5側(cè)翼序列；序列比對(duì)結(jié)果顯示D33

4、和B17中被突變的基因均為功能未知的基因，本研究分別命名為hd33基因和hb17基因。根據(jù)突變菌株D33的鳥槍法克隆的測序結(jié)果設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增目標(biāo)基因的一段序列，構(gòu)建自殺載體17A-pSR47s，對(duì)野生型菌株Ha17A進(jìn)行定位突變，得到了致病力完全喪失的突變菌株17A-hd33，證明hd33基因與菌株Ha17A的致病性密切相關(guān)。 本研究所建立的離體葉片篩選法，為燕麥?zhǔn)乘峋鞴蟻喎N致病性減弱突變菌株的篩選工作提供了一個(gè)相對(duì)便捷的實(shí)驗(yàn)