西瓜細(xì)菌性果斑病菌的PCR檢測(cè).pdf

1、西瓜細(xì)菌性果斑病是由燕麥?zhǔn)乘峋鞴蟻喎NAcidovorax avenae subsp. citrulli引起，是一種重要的植物檢疫性病害。病原菌可以危害西瓜，哈密瓜，甜瓜等，因此對(duì)瓜類生產(chǎn)及相關(guān)產(chǎn)業(yè)構(gòu)成了極大的威脅。該病主要是靠種子傳播，因此有必要建立一套快速，準(zhǔn)確，便捷的檢測(cè)西瓜細(xì)菌性果斑病菌的方法。
　　 本研究采用通用引物擴(kuò)增了燕麥?zhǔn)乘峋鞴蟻喎N和燕麥?zhǔn)乘峋ㄌ厝R蘭亞種16SrDNA，并擴(kuò)增了燕麥?zhǔn)乘峋鞴蟻喎N及其近緣種的

2、ITS序列。根據(jù)ITS序列的差異設(shè)計(jì)并篩選出了可用于燕麥?zhǔn)乘峋鞴蟻喎N檢測(cè)的特異引物TIF2:5-GCTGGATCACCTCCTTTCTG-3和TIR3:5-TGACGCAATCAAATTTTTGTCA-3。對(duì)PCR程序進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果表明，西瓜細(xì)菌性果斑病菌可以擴(kuò)增到一條462bp的特異片段，而燕麥?zhǔn)乘峋鞴蟻喎N的近緣種以及本研究供試的其它菌株均擴(kuò)增不到條帶，菌液PCR時(shí)，檢測(cè)的靈敏度為105CFU/mL，整個(gè)過程大約90min。

3、>　　 采用降落PCR擴(kuò)增了燕麥?zhǔn)乘峋鞴蟻喎N及其近緣種的gyrB基因，設(shè)計(jì)了可用于燕麥?zhǔn)乘峋鞴蟻喎N檢測(cè)的巢式PCR引物，外側(cè)引物GTF:5-GTGCTCTGCTTCACCAACAACA-3，GTR:5-TCAGGGTCTCTCCGTCCAGG-3；內(nèi)側(cè)引物GTF2:5-ATCGGCAAGTACATCGAGCAGAAT-3；GTR2:5-TCGACGATGTAGATCTCGCTCAGG-3。對(duì)巢式PCR程序進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果表明，西瓜細(xì)

4、菌性果斑病菌可以擴(kuò)增到一條395bp的特異片段，而燕麥?zhǔn)乘峋鞴蟻喎N的近緣種以及本研究供試的其它菌株均擴(kuò)增不到條帶，使用巢式PCR對(duì)菌液進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，靈敏度為103CFU/mL，整個(gè)過程大約2h。
　　 基于DNA的PCR技術(shù)，死細(xì)胞和活細(xì)胞的PCR結(jié)果都為陽性，因此如何在檢測(cè)的時(shí)候排除死細(xì)胞的影響成為了研究的熱點(diǎn)。本研究探索了DNA染料(Ethidiummonoazide)在區(qū)別西瓜細(xì)菌性果斑病菌死活細(xì)胞上的應(yīng)用，結(jié)果顯示當(dāng)死細(xì)