水稻細(xì)菌性谷枯病菌的風(fēng)險(xiǎn)分析、鑒定檢測(cè)及其拮抗細(xì)菌的研究.pdf

1、水稻細(xì)菌性谷枯病菌Burkholderia glumae引起谷枯和苗腐，已對(duì)發(fā)生國(guó)家的水稻生產(chǎn)構(gòu)成重大威脅。我國(guó)除臺(tái)灣外，還沒有該病害的發(fā)生報(bào)道，由于其檢疫重要性，農(nóng)業(yè)部擬將其列入進(jìn)境檢疫性有害生物，然而，國(guó)內(nèi)有關(guān)該菌的研究尚是空白。 本論文研究主要進(jìn)行了水稻細(xì)菌性谷枯病菌的定量風(fēng)險(xiǎn)分析：浙江與黑龍江省部分主栽水稻品種對(duì)水稻細(xì)菌谷枯病的抗性分析；中國(guó)水稻稻種內(nèi)潛伏谷枯病菌的分離鑒定；免疫吸附富集(ISE)方法和經(jīng)典PCR方法結(jié)合

2、等檢測(cè)技術(shù)；水稻稻種水稻細(xì)菌性谷枯病拮抗細(xì)菌評(píng)價(jià)及生防效果測(cè)定。取得了如下主要研究結(jié)果： 1.本研究在收集資料和試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，結(jié)合我國(guó)的實(shí)際情況，參照國(guó)際植物檢疫措施的標(biāo)準(zhǔn)和國(guó)內(nèi)有害生物風(fēng)險(xiǎn)分析實(shí)例，構(gòu)建了以有害生物為起點(diǎn)的水稻細(xì)菌性谷枯病菌的風(fēng)險(xiǎn)分析(PRA)體系，首次應(yīng)用生物安全評(píng)估公式R=f(S，P)的簡(jiǎn)化公式R=S×P去運(yùn)算水稻細(xì)菌性谷桔病的風(fēng)險(xiǎn)系數(shù)(R)，客觀的解決了有害生物風(fēng)險(xiǎn)與主要的風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)因子之間的運(yùn)算關(guān)系，簡(jiǎn)化

3、了PRA程序，縮短了PRA的時(shí)間，運(yùn)算出風(fēng)險(xiǎn)系數(shù) R=8.4，屬于高度危險(xiǎn)有害生物(R值在6-9為高度危險(xiǎn)有害生物)；用已經(jīng)發(fā)表的有害生物評(píng)估指標(biāo)的體系對(duì)該體系進(jìn)行了初步驗(yàn)證，R值為2.13(R值在2-2.5內(nèi)為高度危險(xiǎn)有害生物)，也顯示屬于高度危險(xiǎn)性有害生物，證明了所建立的水稻細(xì)菌性谷枯病的PRA體系是可行的。確定了水稻細(xì)菌性谷枯病在我國(guó)屬于高度危險(xiǎn)性有害生物，并提出了相關(guān)的風(fēng)險(xiǎn)管理措施。這是中國(guó)首次對(duì)水稻細(xì)菌性谷桔病菌進(jìn)行的定量風(fēng)險(xiǎn)

4、分析。 2.本研究在抽穗期通過(guò)對(duì)18個(gè)主栽水稻品種接種4株B.glumae，結(jié)果顯示所有的水稻品種均呈現(xiàn)不同程度的感病，沒有發(fā)現(xiàn)抗病品種。水稻品種以空育131最為感病，丙9904表現(xiàn)中抗；病原菌株以B2012致病性最強(qiáng)，B.2012b致病性最弱。以濃度108cfu/ml的B.glumae懸浮液接種稻種，病菌對(duì)稻種的發(fā)芽率并無(wú)影響，但可以引起98％的秧苗腐敗枯死；孕穗期以注射法接種上述濃度的菌懸液于劍葉葉鞘內(nèi)側(cè)，使病原細(xì)菌直接與幼

5、穗接觸，葉鞘和幼穗皆被感染，發(fā)生病變呈現(xiàn)深褐色：孕穗期以噴霧法接種上述濃度的菌懸液，未發(fā)現(xiàn)葉鞘的病變，但會(huì)引起60％以上以上的谷粒被侵染而呈現(xiàn)不飽實(shí)：在抽穗期以噴霧法接種上述濃度的菌懸液，也未見葉鞘的病變現(xiàn)象，稻穗對(duì)B. glumae菌株在抽穗前2日至抽穗后2日期間最為感病。 3.為明確我國(guó)水稻稻種上是否存在水稻細(xì)菌性谷枯病菌，以及早防范該病。經(jīng)對(duì)623份樣晶的多年病原分離監(jiān)測(cè)，于2006年在2份浙江省來(lái)自海南的從來(lái)見明顯水稻細(xì)

6、菌性谷桔病癥狀的秈稻稻種上分離出6株病原細(xì)菌，經(jīng)25項(xiàng)主要細(xì)菌學(xué)特性、菌落形態(tài)、致病性、BIOLOG、脂肪酸分析、RAPD-PCR鑒定及與4株標(biāo)準(zhǔn)菌株比較，證實(shí)了它們系Burkholderia glumae，是引起水稻細(xì)菌性谷枯病的病原。B.glumae分離率為0.32％，這是中國(guó)大陸首次證實(shí)“健康稻種”也存在水稻細(xì)菌性谷枯病菌。 4.本研究將免疫吸附富集(ISE)和經(jīng)典PCR結(jié)合以提高檢測(cè)效率，并且利用多克隆抗體技術(shù)成功的獲得

7、了4種抗血清，即抗Burkholderia glumae全菌體血清ASBg14、ASBg32、ASBg26和ASBg04，ODD法測(cè)定該4種抗血清的效價(jià)均達(dá)到1∶32以上，利用凝聚法測(cè)定的效價(jià)所有抗血清的效價(jià)也均達(dá)到了1∶5120以上，通過(guò)兩種方法結(jié)合測(cè)定效價(jià)均顯示為合格抗體。通過(guò)對(duì)4種抗血清的?；赃M(jìn)行研究，結(jié)果顯示ASBg14和ASBg32?；暂^高，抗血清ASBg26和ASBg04專化性不是很理想。用直接PCR技術(shù)和免疫捕捉PCR

8、技術(shù)檢測(cè)谷桔病菌，結(jié)果表明，所有谷桔病菌都能產(chǎn)生500bp左右的特異性片段，非谷枯病菌的8個(gè)菌株均無(wú)特異性片段產(chǎn)生。兩種檢測(cè)方法的靈敏度比較發(fā)現(xiàn)，直接PCR技術(shù)能榆測(cè)到1×105cfu/ml左右的懸浮液，免疫捕捉PCR技術(shù)能檢測(cè)到103cfu/ml左右懸浮液，免疫捕捉PER比直接PER靈敏性提高102倍。檢測(cè)人工接種的病稻種實(shí)驗(yàn)中，直接PCR技術(shù)能檢測(cè)到2粒及以上帶菌種子制得浸懸液，而免疫捕捉PCR技術(shù)僅1粒帶菌種子即可。 5.

9、從432份隨機(jī)采集的水稻樣品中分離到4253個(gè)細(xì)菌分離物，在離體條件下測(cè)定它們對(duì)水稻谷枯病菌的拮抗能力，結(jié)果顯示，有23個(gè)菌株對(duì)谷桔病菌有很好拮抗效果，其中有40％谷枯病拮抗菌對(duì)水稻紋枯病、水稻惡苗病和水稻細(xì)菌性條斑病菌也產(chǎn)生了較好的生防效果，表現(xiàn)出一定的廣譜性；對(duì)5株拮抗活性較高的菌株進(jìn)行了細(xì)菌代謝產(chǎn)物的活性測(cè)定，2株拮抗細(xì)菌(T021、S087)的培養(yǎng)濾液對(duì)水稻谷枯枯病菌有較高的拮抗活性，其中T021對(duì)B.glumae和水稻紋枯病菌