蝴蝶蘭細(xì)菌性軟腐病菌分子檢測(cè)技術(shù)的研究.pdf

1、蝴蝶蘭細(xì)菌性軟腐病是蝴蝶蘭的頭號(hào)殺手。Erwiniachrysanthemi(菊歐文氏菌)、Erwiniacarotovorasubsp.carotovora(胡蘿卜軟腐歐文氏菌胡蘿卜軟腐亞種)是引起蝴蝶蘭軟腐病的主要病原細(xì)菌。據(jù)調(diào)查，在我國(guó)造成蝴蝶蘭軟腐病的細(xì)菌都是Erwiniachrysanthemi，被列入我國(guó)三類檢疫性有害生物。 本論文主要進(jìn)行了菊歐文氏菌檢測(cè)技術(shù)的研究。 選用16S-23SrDNA間的ITS(I

2、ntergenicTranscribedSpacerRegion)序列的通用引物A(5’-GAAGTCGTAACAAGG-3’)和B(5’-CAAGGCATCCACCGT-3’)，對(duì)菊歐文氏菌3個(gè)菌株進(jìn)行了ITS擴(kuò)增，所有菌株均得到了一條分子量約為240bp的擴(kuò)增產(chǎn)物。對(duì)參試的3個(gè)菊歐文氏菌菌株的擴(kuò)增片段進(jìn)行片段回收、克隆和測(cè)序，將這些序列與數(shù)據(jù)庫(kù)中已報(bào)道的其它ITS序列進(jìn)行同源性比較，在此基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)并合成菊歐文氏菌特異性引物L(fēng)1(5’

3、-CCGGATTGTTAAAGAGCAGA-3’)和L2(5’-GACGCCAATGACTGACAGTG-3’)。并用這對(duì)特異性引物分別對(duì)14個(gè)參試菌株進(jìn)行PCR擴(kuò)增，證明這對(duì)特異性引物具有很高的特異性。 利用免疫吸附技術(shù)，研制了免疫吸附-PCR技術(shù)。選用菊歐文氏菌的001菌株，由戊二醛固定全菌體抗原，制備的抗血清效價(jià)和特異性都比較高，可以用于ELISA實(shí)驗(yàn)。應(yīng)用免疫吸附-PCR技術(shù)，使檢測(cè)純菌的靈敏度比標(biāo)準(zhǔn)PCR技術(shù)提高10倍

4、，檢測(cè)樣品中菊歐文氏菌靈敏度提高了100倍。該方法簡(jiǎn)單易行，準(zhǔn)確靈敏，具有廣泛的應(yīng)用前景。 實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)是一種新近發(fā)展起來(lái)的檢測(cè)技術(shù)。本研究采用SYBRGREENI染料法，用多個(gè)引物分別對(duì)菊歐文氏菌進(jìn)行擴(kuò)增，從而進(jìn)一步驗(yàn)證了特異性引物L(fēng)1-L2具有很高的特異性；用此法檢測(cè)樣品中菊歐文氏菌的靈敏度可達(dá)到102cfu/ml，比標(biāo)準(zhǔn)PCR技術(shù)提高了1000倍。SYBRGREENI染料法不需要設(shè)計(jì)合成序列特異性的探針，是一種簡(jiǎn)