蝴蝶蘭花序分生組織基因LFY表達(dá)載體構(gòu)建及對(duì)蝴蝶蘭的遺傳轉(zhuǎn)化.pdf

1、LFY是花分生組織特性基因(floral meristern identity gene),廣泛表達(dá)于植物的營(yíng)養(yǎng)器官和生殖器官。LFY與調(diào)控植物開(kāi)花時(shí)間的基因密切相關(guān),調(diào)控開(kāi)花時(shí)間的四條途徑均表達(dá)于LFY基因的上游且在LFY基因處整合,LFY在花誘導(dǎo)后表達(dá)水平加強(qiáng)。通過(guò)對(duì)模式植物擬南芥LFY基因研究的深入,發(fā)現(xiàn)LFY基因是一個(gè)控制花序梢分生組織特征的基因,LFY參與促進(jìn)花分生組織的形成和花分生組織屬性的控制,參與維持花分生組織的正常功能

2、、花啟動(dòng)、防止花分生組織的逆轉(zhuǎn)。在花分生組織屬性基因中LFY基因是首先表達(dá)的。LFY編碼了一個(gè)發(fā)育開(kāi)關(guān),其活性足以將所有側(cè)梢轉(zhuǎn)變成單花芽,從而誘導(dǎo)植株提早開(kāi)花。植物L(fēng)FY基因表達(dá)量只有達(dá)到一定值時(shí)才能成花,同時(shí)其過(guò)量表達(dá)不影響花模式且能提前成花。生物技術(shù)的迅速發(fā)展啟發(fā)人們用轉(zhuǎn)基因的手段研究應(yīng)用LFY基因,在轉(zhuǎn)LFY基因楊樹(shù)、煙草、菊花和水稻等植物中,LFY的超量表達(dá)均使花期提前。
　　 本實(shí)驗(yàn)在吸取前人經(jīng)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,構(gòu)建了適合植

3、物的表達(dá)載體pRI101-LFY,并將其轉(zhuǎn)化進(jìn)入根癌農(nóng)桿菌EHA105中,通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將LFY基因轉(zhuǎn)入蝴蝶蘭中,然后對(duì)轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行檢測(cè),借以初步探討LFY基因在蝴蝶蘭中的轉(zhuǎn)化和表達(dá)情況,使LFY基因能夠超量表達(dá),從而獲得能提前開(kāi)花的蝴蝶蘭品種。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下:
　　 (1)蝴蝶蘭LFY基因的獲取及克隆
　　 根據(jù)ncbi中已報(bào)道的蝴蝶蘭LFY基因序列,運(yùn)用RT-PCR法擴(kuò)增出LFY基因,連接至克隆載體pMD19-T后

4、轉(zhuǎn)化E.coli DH5a,通過(guò)質(zhì)粒PCR、雙酶切、測(cè)序鑒定,得到重組質(zhì)粒pMD19-T-LFY。
　　 (2)蝴蝶蘭LFY基因植物表達(dá)載體pRI101-LFY的構(gòu)建與鑒定
　　 利用DNA重組技術(shù),將蝴蝶蘭LFY基因克隆至植物表達(dá)載體pRI101中后轉(zhuǎn)化E.coliDH5a,通過(guò)質(zhì)粒PCR、雙酶切、電泳鑒定證明蝴蝶蘭LFY基因植物表達(dá)質(zhì)粒pRI101-LFY成功構(gòu)建。
　　 (3)pRI101-LFY質(zhì)粒轉(zhuǎn)化根

5、癌農(nóng)桿菌
　　 將重組質(zhì)粒pRI101-LFY通過(guò)直接轉(zhuǎn)化法導(dǎo)入根癌農(nóng)桿菌EHA105中,用利福平(Rif)和卡那霉素(Kana)進(jìn)行篩選得到陽(yáng)性克隆,通過(guò)質(zhì)粒PCR,雙酶切鑒定證明重組質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌EHA105。
　　 (4)蝴蝶蘭再生體系的建立
　　 采用無(wú)菌蝴蝶蘭原球莖為外植體,以MS為基本培養(yǎng)基,篩選出播種培養(yǎng)基:1/4 MS+KT0.5mg/l+AC1g/l+蛋白胨1g/l+椰汁50％,成苗培養(yǎng)

6、基:1/2 MS+NAA5mg/l+IBA5m g/l+AC0.5％+土豆50g/l,分化培養(yǎng)基:1/2 MS+6-BA10mg/L+椰汁20g/l,生根培養(yǎng)基:1/2 MS+6-BA0.3mg/l。
　　 (5)轉(zhuǎn)化體篩選及植株再生
　　 將預(yù)培養(yǎng)3-4天的原球莖與農(nóng)桿菌菌液浸染5-15分鐘后,共培養(yǎng)2-3天,然后轉(zhuǎn)化到含MLPN和Kana的選擇培養(yǎng)基上進(jìn)行分化篩選,轉(zhuǎn)入外源基因的原球莖將會(huì)在這一系列篩選過(guò)程中發(fā)芽、生