瓜類細(xì)菌性果斑病菌分子檢測(cè)技術(shù)的研究及應(yīng)用.pdf

1、本研究根據(jù)瓜類病原細(xì)菌可溶性蛋白的特異性，建立鑒定瓜類細(xì)菌性果斑病菌(Acidovoraxavenaesubsp.citrulli，簡(jiǎn)稱A.a.c)的SDS-PAGE方法，根據(jù)SDS-PAGE圖譜直接鑒定出瓜類細(xì)菌性果斑病原菌，為植物檢疫部門(mén)檢測(cè)該類病菌提供一種快速、準(zhǔn)確的方法。 利用細(xì)菌16SrDNA基因的通用引物對(duì)供試菌株進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行核苷酸序列測(cè)定。將獲得的序列與GenBank中相關(guān)菌株的16SrDNA序列

2、進(jìn)行同源性分析。利用最大簡(jiǎn)約法構(gòu)建了16SrDNA系統(tǒng)演化樹(shù)，并設(shè)計(jì)出檢測(cè)A.a.c的特異性引物。利用設(shè)計(jì)的特異性引物(BFB64/65)對(duì)各供試菌株進(jìn)行PCR檢測(cè)，結(jié)果只有A.a.c菌株產(chǎn)生擴(kuò)增泳帶，產(chǎn)物大小與預(yù)期一致。因此，構(gòu)建了快速檢測(cè)A.a.c病菌的PCR方法。 根據(jù)瓜類細(xì)菌性果斑病菌與相關(guān)細(xì)菌16SrDNA序列差異，設(shè)計(jì)出對(duì)A.a.c具有穩(wěn)定點(diǎn)突變特異性探針Aac-probe，利用該探針對(duì)供試菌株進(jìn)行了實(shí)時(shí)熒光PCR檢

3、測(cè)試驗(yàn)。結(jié)果表明，除瓜類細(xì)菌性果斑病菌能檢測(cè)到熒光增強(qiáng)信號(hào)外，其余菌株無(wú)熒光增強(qiáng)信號(hào)。實(shí)時(shí)熒光PCR的相對(duì)靈敏度明顯高于常規(guī)PCR，表現(xiàn)出特異性強(qiáng)，靈敏度高，重復(fù)性好，可有效地應(yīng)用于A.a.c菌的檢測(cè)。 本研究首次構(gòu)建瓜類細(xì)菌性果斑病菌可溶性蛋白的SDS-PAGE檢測(cè)方法；首次對(duì)A.a.c菌株16SrDNA序列進(jìn)行同源性分析，建立其在細(xì)菌系統(tǒng)演化樹(shù)上的分類地位；首次對(duì)實(shí)時(shí)熒光PCR體系進(jìn)行優(yōu)化，建立了對(duì)A.a.c的TaqMan實(shí)