實時熒光pcr檢測玉米細菌性枯萎病菌pantoeastewartiisubsp.stewartii的研究

1、湖南農業(yè)大學碩士學位論文實時熒光PCR檢測玉米細菌性枯萎病菌（Pantoea stewartiisubsp.stewartii）的研究姓名：漆艷香申請學位級別：碩士專業(yè)：植物病理學指導教師：肖啟明;朱水芳2003.6.1實時熒光P C R 檢測玉米細菌性枯萎病菌( [ ) c l l T [ O C ' d 。Y ≠洲d l ? t t i is u b s p 。f 蹦塒，i i i ) 的研究中文摘要玉米細菌性枯萎病是玉米上

2、的一種毀滅性的病害；尤其對甜玉米更甚，在嚴重情況下可造成顆粒無收。目前我國尚無正式分布的報道，是被我國列為禁止進境一類檢疫性有害生物。在我國口岸的檢疫中，一直沿用傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)、生理生化鑒定、噬菌體檢測、免疫熒光染色和致病性試驗等檢驗的方法。應用該類方法耗時長、效率和靈敏度均較低，且經驗性很強，又往往難以確定準確的細菌種類，不適合口岸快速驗放的要求，難以標準化和大規(guī)模的推廣應用，這些也J 下是目前細菌病原缺乏標準檢測方法的重要原因。建立

3、快速、準確的檢測方法迫在眉睫、意義重大。本研究成功建立了玉米細菌性枯萎病菌檢測的T a q M a n 探針實時熒光P C R 檢測方法，且在國內外未見相同方法報道。將玉米細菌性枯萎病菌1 6 Sr D N A 基因克隆測序，根據(jù)本細菌與其它細菌菌株1 6 Sr D N A 序列差異，設計出對玉米細菌性枯萎病菌具有穩(wěn)定點突變的特異性探針，除泛菌屬3 個種和歐氏菌屬3 個種外，還對假單胞菌屬1 個種，黃單胞菌屬1 個種，棒形桿菌屬1 個種

4、，短d , g N N1 個種以及5 種植原體進行了實時熒光P C R 。結果表明，只有玉米細菌性枯萎病菌產生熒光，其他細菌和植原體都沒有熒光產生。且絕對靈敏度比凝膠電泳高1 0 0 倍，達到2 ．5 3 ×1 0 6 個陽性分子。檢測的靈敏度為1 0 4 C F U ／m L 的菌懸浮液，相當于4 個細菌細胞的基因，靈敏度高，也就是說，反應體系C R a g 有2 個活細菌，實時熒光P C R 就能檢測到。相對靈敏度為1 0