實時熒光定量PCR技術(shù)用于土壤中小麥紋枯病菌的定量檢測及動態(tài)分析.pdf

1、小麥紋枯病是由禾谷絲核菌（Rhizoctonia cerealis）引起的土傳真菌性病害，是影響小麥高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)的重要病害之一，遍布世界各溫帶小麥種植區(qū)。小麥紋枯病在我國主要發(fā)生在江淮流域及黃河中下游冬麥區(qū)，其中江蘇、浙江、安徽、山東、河南、陜西、湖南、湖北及四川等冬小麥主產(chǎn)區(qū)發(fā)病普遍，其危害呈逐年增長的趨勢。小麥紋枯病以菌核或病殘體上的菌絲在土壤中越夏和越冬，在小麥的整個生長季節(jié)都可以侵染危害。傳統(tǒng)的病菌測定方法難以實現(xiàn)對土壤中的小麥紋枯

2、病菌的定量檢測。本研究利用real-time PCR技術(shù)，成功設(shè)計了一對針對小麥紋枯病菌具有特異性的引物，分別于2012、2013年春天（3月3日）開始，以10d作為一個間隔對土壤中小麥紋枯病菌的生物量進行定量檢測，得到土壤中小麥紋枯病菌的消長動態(tài)曲線。同時利用當(dāng)?shù)貧庀笳就奖O(jiān)測的氣象資料得到田間10d平均有效積溫變化曲線及自采樣點麥田調(diào)查得到的田間小麥紋枯病的病情指數(shù)變化曲線，并分析了三者的關(guān)系。主要研究結(jié)果如下：
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3、麥紋枯病菌5.8SrDNA-ITS區(qū)的序列，設(shè)計了小麥紋枯病菌的特異性引物對WKF-8/WKR-8，采用CTAB法提取小麥紋枯病菌wk-206(R.cerealis AG-D)菌株的DNA，利用常規(guī)PCR擴增，產(chǎn)生了大小約200bp的目的片段。以小麥紋枯病菌(R.cerealisAG-D)、棉花立枯病菌（R.solani AG4-HG-Ⅰ，AG4-HG-Ⅲ）、馬鈴薯黑痣病菌（R.solaniAG3，AG4）、玉米紋枯病菌(R.solan

4、i AG4-HG-Ⅲ，AG1-IB)、層出鐮孢菌(Fusariumproliferum)、麥根腐平臍蠕孢（Bipolaris sorokiniana）和其他雙核類絲核菌標(biāo)準(zhǔn)菌株DNA為模板進一步對所設(shè)計的引物的特異性進行檢測。電泳結(jié)果顯示只有以小麥紋枯病菌菌株DNA為模板時可擴增產(chǎn)生目的片段，以其他檢測菌株為模板時無目的片段產(chǎn)生，證明引物對WKF-8/WKR-8對小麥紋枯病菌能進行特異性檢測。
　?、评迷O(shè)計的特異性引物，將退火溫

5、度在58℃～62℃間進行優(yōu)化，選擇58.4℃為最佳退火溫度，建立基于SYBR GreenⅠ熒光染料法的real-time PCR反應(yīng)體系。利用CTAB法提取小麥紋枯病菌wk-206菌株的DNA，經(jīng)檢測其濃度為2.02×102ng/μl，將該DNA進行稀釋后，獲得10倍梯度稀釋的DNA系列濃度。利用常規(guī)PCR技術(shù)和實時熒光定量PCR技術(shù)分別檢測引物的靈敏度，結(jié)果顯示，常規(guī)PCR的檢測下限為1.0×10-3ng/μl，實時熒光定量PCR的檢

6、測下限為1.0×10-5ng/μl，實時熒光定量PCR的靈敏度較常規(guī)PCR高100倍。
　　⑶以系列稀釋的wk-206菌株的DNA為模板，進行實時熒光定量PCR擴增，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。擴增結(jié)果顯示，當(dāng)模板濃度在1.0×10-1～1.0×103ng/μl之間時呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，決定系數(shù)為0.995，擴增效率為99.7％，線性范圍可達5個數(shù)量級。溶解曲線目的產(chǎn)物溶解溫度為（83±0.5）℃，產(chǎn)物單一，無引物二聚體產(chǎn)生，符合熒光定量參數(shù)的

7、要求范圍。證明該標(biāo)準(zhǔn)曲線可以用于土壤中小麥紋枯病菌的定量檢測。
　　⑷綜合兩年土壤中小麥紋枯病菌（R.cerealis）生物量的檢測結(jié)果表明，土壤中病原菌的生長趨勢大致相同，在采樣期間病原菌的數(shù)量有兩個明顯的上升高峰，分別在四月中旬和五月下旬，分別對應(yīng)于小麥生長時期的拔節(jié)初期和蠟熟期。兩年的檢測結(jié)果間的差異表現(xiàn)在2012年對土壤中小麥紋枯病菌的生物量高峰出現(xiàn)于4月12日，2013年土壤中小麥紋枯病菌的生物量高峰出現(xiàn)于4月22日。這

8、種差異與同期兩年田間10d有效積溫存在較大差異有關(guān)。
　?、删C合分析田間調(diào)查的小麥紋枯病的病情指數(shù)變化曲線和土壤中小麥紋枯病菌生物量的變化曲線可以看出，田間小麥紋枯病病情指數(shù)增長快速的時期恰巧對應(yīng)于土壤中病菌生物量檢測出現(xiàn)升高-高峰-下降-第二個高峰的時期，在這個階段也正是土壤中紋枯病菌循序轉(zhuǎn)移至小麥植株上并進行快速擴展的時期;土壤中小麥紋枯病菌生物量第二個高峰的出現(xiàn)也是小麥紋枯病菌自小麥植株再次轉(zhuǎn)移至土壤中的一個重要標(biāo)志。土壤中