轉(zhuǎn)hpalxoo基因棉花抗病蟲防衛(wèi)反應(yīng)與全基因組轉(zhuǎn)錄譜分析及棉花角斑病菌hpaXm基因的功能.pdf

1、棉花是世界上重要的纖維作物，也是重要的油料來(lái)源．在許多植棉國(guó)家，棉花黃萎病、枯萎病是危害棉花的兩大病害。從1993年以來(lái)，黃萎病在我國(guó)嚴(yán)重發(fā)生，發(fā)病面積占全國(guó)植棉面積的50％左右，每年損失皮棉約10萬(wàn)噸。目前尚無(wú)有效的方法控制該類病害的危害．通過(guò)植物基因工程，可以把優(yōu)良抗性基因轉(zhuǎn)移到植物體內(nèi)，對(duì)植物進(jìn)行定向改造，從而培育新的優(yōu)良抗病品種，為棉花黃、枯萎病的有效防治開辟了新的防治途徑，已經(jīng)證明harpin是一類蛋白激發(fā)子，具有無(wú)毒、無(wú)公害

2、和對(duì)環(huán)境友好等優(yōu)點(diǎn)，先前研究表明噴施harpin能增強(qiáng)植物抗病、抗蟲性，而內(nèi)源表達(dá)harpin顯示轉(zhuǎn)基因植物（水稻、煙草、梨等）能抗多種病害，由此，通過(guò)基因工程方法將harpin編碼基因hrp導(dǎo)入重要的經(jīng)濟(jì)作物棉花中，是否會(huì)使棉花獲得各種抗性及其它有益表型呢？此外，harpin在分子水平上的作用機(jī)理和作用位點(diǎn)還不是很清楚，尤其在無(wú)脅迫下內(nèi)源表達(dá)的harpin對(duì)植物的防衛(wèi)、生長(zhǎng)發(fā)育會(huì)產(chǎn)生怎樣的影響？本研究將來(lái)自水稻白葉枯病菌的hpalxo

3、o基因轉(zhuǎn)入棉花，使harpin的多種功能在棉花中得以表達(dá)，獲得抗棉花黃、枯萎病等多種有益表型的轉(zhuǎn)基因棉花株系，并力圖解析harpin對(duì)植物的作用機(jī)理；與此同時(shí)，我們還從棉花角斑病菌（X.citri subsp.malvacearum）基因組中克隆了編碼harpin的hpaXm基因．現(xiàn)將結(jié)果分述如下：
　　 利用含有農(nóng)桿菌T-DNA區(qū)的重組質(zhì)粒，結(jié)合花粉管通道技術(shù)，將hpal Xoo基因分別轉(zhuǎn)化陸地棉品種中棉35(Z35)、海島棉

4、品種新海21等棉花品種，通過(guò)苗期的卡那霉素或除草劑篩選并結(jié)合室內(nèi)和病圃枯萎病和黃萎病抗性單株篩選，獲得了30份轉(zhuǎn)基因材料．在卡那抗性植株篩選基礎(chǔ)上，大部分轉(zhuǎn)基因植株符合孟德?tīng)栠z傳規(guī)律，即后代存在3:1或者1：3的分離，部分轉(zhuǎn)基因株系到T6代就具有100%的純合株系（如T-34部分單株株系后代）．同時(shí)采用農(nóng)桿菌莖尖介導(dǎo)法，也獲得攜帶有hpal Xoo基因的轉(zhuǎn)基因植株．選擇部分轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行加代選育，在棉花黃，枯萎病病圃進(jìn)行了抗病性，農(nóng)藝性

5、狀評(píng)價(jià)，以及采用生測(cè)法評(píng)價(jià)轉(zhuǎn)基因植株的抗蟲性．供試轉(zhuǎn)基因材料中，針對(duì)棉花黃萎病，獲得了抗病材料（系）8個(gè)，耐病材料（系）8個(gè)，病指范圍在13.75%-38.49%．轉(zhuǎn)基因材料病指均低于出發(fā)品種(Z35)，Z35病指為45.34%．與Z35相比，轉(zhuǎn)基因棉黃萎病平均發(fā)病率減少42.9%，病指減少7.35%-26.22%;枯萎病病指減少52.46%-59.02%;立枯病病指減少58.70%-59.24%．在抗蟲性調(diào)查的初步結(jié)果中，部分轉(zhuǎn)基因材

6、料（如T-3、T-34）對(duì)棉鈴蟲表現(xiàn)出較好的抗性。飼喂T-34棉葉的棉鈴蟲發(fā)育明顯遲緩，直至死亡，5天后棉鈴蟲死亡率為90.95%，而飼喂Z35棉葉的棉鈴蟲死亡率為12.20%。這些結(jié)果表明harpinxoo的表達(dá)賦予轉(zhuǎn)hpalxoo基因棉花抗病蟲性。
　　 轉(zhuǎn)基因抗病材料的棉鈴有大、有小。生長(zhǎng)前期，轉(zhuǎn)基因植株的株高一般低于出發(fā)品種，但開花以后至成熟，轉(zhuǎn)基因材料的生長(zhǎng)逐漸與出發(fā)品種接近，與出發(fā)品種無(wú)顯著性差異。轉(zhuǎn)基因棉花生育期為

7、120-121天，長(zhǎng)于Z35（116天）。部分轉(zhuǎn)基因材料在農(nóng)藝性狀方面優(yōu)于Z35，如轉(zhuǎn)基因株系T-33，在棉花吐絮期(2007)，與Z35相比，無(wú)效枝數(shù)低了0.12個(gè)，有效桃數(shù)多了0.1個(gè)；轉(zhuǎn)基因株系T-34果枝數(shù)比對(duì)照Z(yǔ)35多了0.1個(gè)。部分轉(zhuǎn)基因材料田間吐絮較暢，纖維品質(zhì)有所改善。2006年通過(guò)農(nóng)業(yè)部棉花纖維檢測(cè)中心檢測(cè)，轉(zhuǎn)基因材料T-33的纖維上半部平均長(zhǎng)度為29.0mm，對(duì)照Z(yǔ)35的纖維長(zhǎng)度為28.8mm;纖維整齊度方面，所有轉(zhuǎn)

8、基因材料(85%)都高于出發(fā)品種(83%)；馬克隆值方面，所有的轉(zhuǎn)基因材料為B級(jí)，對(duì)照Z(yǔ)35為C級(jí)。轉(zhuǎn)基因株系T-34纖維伸長(zhǎng)率為5.8%，而對(duì)照(Z35)的纖維伸長(zhǎng)率為5.5%。因此，綜合諸多性狀，我們選擇轉(zhuǎn)基因植株T-34（或T-33）作為本研究的主要對(duì)象。
　　 從PCR擴(kuò)增到目的基因（hpalXoo）的陽(yáng)性植株中選擇了T-34和T-33，作進(jìn)一步的分子鑒定。PCR Southern blot和基因組Southern bl

9、ot確定了hpal Xoo已經(jīng)整合到棉花基因組中，且具有至少3個(gè)拷貝，提取PCR檢測(cè)均為陽(yáng)性的植株的可溶性蛋白，進(jìn)行了Western blot分析，在PCR陽(yáng)性植株中可檢測(cè)到harpinXoo蛋白的表達(dá)．RT-PCR結(jié)果同樣證實(shí)了hpa1Xoo在轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)．采用免疫膠體金定位技術(shù)，觀察到harpinXoo免疫金顆粒主要分布在植物的細(xì)胞壁上，膠體金顆粒在轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞壁上呈10-20粒簇狀特異性分布，在葉綠體或線粒體上則未見(jiàn)到特異性吸

10、附，這個(gè)結(jié)果說(shuō)明harpinXoo在轉(zhuǎn)基因棉花中作用位點(diǎn)是細(xì)胞壁。同時(shí)，采用PCR和Bt蛋白檢測(cè)試紙條方法檢測(cè)轉(zhuǎn)基因材料中是否含有Bt基因及其編碼蛋白，結(jié)果表明供檢測(cè)的轉(zhuǎn)hpalXoo基因棉花對(duì)棉鈴蟲的抗性是由于取食表達(dá)harpinXoo的植株引起的，而與Bt基因無(wú)關(guān)．
　　 表達(dá)harpinxoo轉(zhuǎn)基因棉花材料T-34在田間和室內(nèi)均對(duì)棉花黃萎病表現(xiàn)出較好的抗性，因此，我們進(jìn)一步從細(xì)胞和分子水平上驗(yàn)證T-34對(duì)棉花黃萎病菌的抗性

11、機(jī)理．通過(guò)T-34懸浮細(xì)胞與棉花黃萎病菌分生孢子共培養(yǎng)，轉(zhuǎn)基因棉花T-34的懸浮細(xì)胞的生存能力顯著高于其出發(fā)品種Z35．在無(wú)病原菌侵染時(shí)，T-34葉片的H202積累高于Z35，但未觀察到肉眼可見(jiàn)的氧爆發(fā)(reactive oxygen intermediates，ROI)現(xiàn)象，說(shuō)明T-34較Z35更易處于一種引發(fā)狀態(tài)(Priming state)，一旦遭到病原菌侵染，T-34葉片中的過(guò)氧化氫酶受到抑制，在T-34葉組織中可以觀察到明顯的

12、氧爆發(fā)和微過(guò)敏(Micro HR.)現(xiàn)象，H202含量也有較高的積累，并呈現(xiàn)病原菌與植物非親和互作的雙峰典型特征，而在Z35葉組織中沒(méi)有觀察到氧爆發(fā)和微過(guò)敏．與這種現(xiàn)象一致，通過(guò)Real Time-PCR檢測(cè)，氧爆發(fā)和微過(guò)敏的標(biāo)志基因ghA OX1、hsr203J及hinl等基因的相對(duì)表達(dá)量也顯著高于出發(fā)品種。這些結(jié)果證明了，由于harpinxoo在轉(zhuǎn)基因植物體中的表達(dá)，激活了植株對(duì)病原菌攻擊的防衛(wèi)反應(yīng)，harpinxoo是植物與病原菌

13、非親合互作中必要的激發(fā)子。
　　 Harpin賦予轉(zhuǎn)基因棉花多種抗性和多個(gè)有益的農(nóng)藝性狀表型，但是在無(wú)脅迫下，harpin影響植株的分子模式還不清楚。為此我們使用棉花12K cDNA芯片，采用生物芯片技術(shù)，分析了harpin Xoo轉(zhuǎn)基因棉花(T-34)與其出發(fā)品種(Z35)的全基因組轉(zhuǎn)錄譜，從而使我們能夠廣泛理解harpin Xoo是如何在轉(zhuǎn)基因棉花中調(diào)控基因表達(dá)的。結(jié)果顯示，與Z35相比，在T-34葉片中存在530個(gè)差異表達(dá)

14、基因．這些差異表達(dá)基因中很多基因涉及過(guò)敏性細(xì)胞死亡(hypersensitive cell death，HCD)、苯丙氨酸解氨酶(phenylalanine ammonia lyase，PAL)、水楊酸(salicylic acid,SA)、茉莉酸(jasmonic acid,JA)、生長(zhǎng)素(auxin)、脫落酸(abscisic acid)和乙烯(ethylene，ET)等基本防衛(wèi)反應(yīng)途徑，在轉(zhuǎn)基因棉花中，Harpin Xoo作為內(nèi)源

15、激發(fā)子，與受體作用或者直接作用于一些蛋白激酶，造成編碼NADPH氧化酶、NAD泛素氧化還原酶、離子通道蛋白（如CLC-C）、鈣結(jié)合蛋白，苯丙氨酸裂解酶(PAL2)，植保素合成酶（如CHS）、MAPK激酶等蛋白酶的基因上調(diào)表達(dá)，并通過(guò)乙烯或生長(zhǎng)素轉(zhuǎn)錄因子（如ERF、ARF）等進(jìn)一步激活下游防衛(wèi)和生長(zhǎng)發(fā)育有關(guān)的反應(yīng)．HarpinXoo在轉(zhuǎn)基因棉花中調(diào)控生長(zhǎng)素相關(guān)基因的表達(dá)符合生長(zhǎng)素信號(hào)途徑；同時(shí)，在LRR-PRKs途徑中多個(gè)激酶編碼基因的表

16、達(dá)，表明LRR-PRKs在harpinXoo誘導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)中也擔(dān)任重要角色．通過(guò)對(duì)芯片上9個(gè)防衛(wèi)相關(guān)基因采用定量或半定量PCR驗(yàn)證，顯示芯片數(shù)據(jù)具有88.98%的可信度。經(jīng)Realtime PCR檢測(cè)，病原菌侵染后，6個(gè)防衛(wèi)相關(guān)基因在轉(zhuǎn)基因植株中超表達(dá)，這個(gè)結(jié)果進(jìn)一步說(shuō)明在無(wú)脅迫下harpinXoo的表達(dá)賦予轉(zhuǎn)基因棉防衛(wèi)水平高于其受體，并保持著基本的防衛(wèi)水平，但在遭受病原菌脅迫下，harpinXoo的表達(dá)具有增強(qiáng)轉(zhuǎn)hpalXoo基因棉防

17、衛(wèi)水平的能力，同時(shí)，差異表達(dá)基因中的共性上調(diào)和下調(diào)表達(dá)以及涉及能量產(chǎn)生和消耗途徑的基因表達(dá)水平的提高，這些結(jié)果意味著在無(wú)脅迫下轉(zhuǎn)基因植物體中維持著一種能量平衡，僅僅當(dāng)病原菌侵染時(shí)才在植物體中產(chǎn)生高能量的需求．
　　 用轉(zhuǎn)hpalXoo基因棉花新鮮葉片飼喂棉鈴蟲，造成棉鈴蟲發(fā)育明顯遲緩．為了更好地解析這一現(xiàn)象，將轉(zhuǎn)基因棉花T-34和出發(fā)品種Z35葉片分別飼喂棉鈴蟲，提取棉鈴蟲幼蟲RNA，利用和棉鈴蟲同屬鱗翅目的家蠶的23K寡核苷酸

18、(Oligo)探針，通過(guò)生物芯片技術(shù)，制作了其Oligo表達(dá)譜芯片．芯片結(jié)果顯示檢測(cè)到了2927個(gè)基因，T-34對(duì)Z35在轉(zhuǎn)錄水平上存在有872個(gè)差異表達(dá)基因，其中Ratio值大于2.0的上調(diào)表達(dá)基因有328個(gè)，Ratio值小于0.5的下調(diào)表達(dá)基因有544個(gè)．872個(gè)差異表達(dá)基因主要涉及13種生物功能，96個(gè)通路(pathway)。棉鈴蟲取食表達(dá)HarpinXoo的棉花葉片后，激發(fā)棉鈴蟲體內(nèi)編碼蛋白水解酶、細(xì)胞色素P450等的基因超表達(dá)

19、，打破了離子調(diào)節(jié)體系和滲透壓平衡體系，消耗棉鈴蟲的大量ATP，從而影響棉鈴蟲蛋白酶分解和合成、ATP合成等多個(gè)生物途徑的正常代謝，造成棉鈴蟲不能很好取食。因此，采用芯片技術(shù)，通過(guò)異源家蠶oligo芯片信息的比對(duì)，初步解析了轉(zhuǎn)hpalXoo棉花對(duì)棉鈴蟲的抗性機(jī)理，可能與棉鈴蟲取食后正常代謝受到干擾，影響發(fā)育有關(guān)。本研究結(jié)果為hpalXoo，作為新的基因資源用于抗棉鈴蟲育種提供了初步證據(jù)，并為抗棉鈴蟲機(jī)理研究展示了新的途徑。
　　

20、Xanthomonas campestris pv.malvacearum(E.F.Smith) Dye(Xcm)是引起棉花角斑病的病原。2006年該病菌學(xué)名更名為X citri subsp,malvacearum nov.comb.nov.nom.nov.(Xcm)。在Xanthomonas中一些編碼harpin的基因已經(jīng)被克隆，但在Xcm中尚未有該基因克隆的報(bào)道。本研究首次報(bào)道了編碼harpin like protein的hpaXm

21、基因。用PCR技術(shù)從Xcm基因組中擴(kuò)增了hpaXm基因。該基因具有402bp，其編碼的蛋白為HpaXm，含有133個(gè)氨基酸，大小為13.3kD，GC含量為60.70%,富含甘氨酸，含量為21.80%，缺乏半胱氨酸。HpaXm的GST融合蛋白表達(dá)的最佳條件是IPTG0.05mM、37℃3h。純化的HpaXm具有熱穩(wěn)定性，煮沸或未煮沸處理的HpaXm都能在煙草上激發(fā)HR。HpaXm能夠增強(qiáng)煙草對(duì)TMV的抗病性，也能激發(fā)nprl、hsr203

22、J、pr-1a、pr-1b等防衛(wèi)基因的表達(dá)。在Xcm基因組中，采用TAIL-PCR(thermalasymmetric interlaced PCR)方法，在hpaXm左翼擴(kuò)增到了與X oryzae pv.oryzae中hrcC基因具有93%同源性的1826bp序列，命名為hrcCXm，但在hrcCXm與hpaXm之間有704bp的間隔序列；在hpaXm右翼，擴(kuò)增得到了與Xoryzae pv.oryzae中hpa2基因具有89%同源生的

23、630bp序列，命名為hpa2Xm．在HpaXm蛋白序列中存在有兩個(gè)Alpha helix區(qū)域．HpaXm可能擁有Coiled coil區(qū)域及亮氨酸拉鏈．通過(guò)完整地氨基酸序列及N端a-helix中13個(gè)保守的殘基(H2N-SEKQLDQLLTQLI-COOH)進(jìn)化樹分析，HpaXm與HpaGXae、HpaXae進(jìn)化關(guān)系要比與HpalXoo和Hpa lXoc更近．我們對(duì)HpaXmN端a-helix區(qū)域中含有兩個(gè)heptad的多肽（39-L