鹽芥HKT1基因的耐鹽功能研究.pdf

1、Na+、K+離子運輸與均衡是植物耐鹽性的一個關(guān)鍵因素。植物受鹽脅迫的一個重要特征即Na+對植物組織的毒害，其主要表現(xiàn)植物受滲透脅迫及離子脅迫，引發(fā)一系列次級脅迫如營養(yǎng)失衡和過氧化脅迫，從而嚴(yán)重干擾植物細(xì)胞及植株的水分和離子穩(wěn)態(tài)，使植物細(xì)胞中的分子受損、植株生長減緩甚至死亡。而K+是植物細(xì)胞中最豐富的游離態(tài)離子，適度的K+在植物生長和代謝中及抗逆性尤其是抗鹽方面擔(dān)任重要作用。 植物的根和地上部均存在大量的轉(zhuǎn)運K+的載體和通道，它們

2、大多定位在質(zhì)膜和液泡膜，從而保證植物從土壤中吸收K+，并利于在不同組織間的分配，使植物在細(xì)胞及整體水平上均能維持高的K+/Na+比率。其中，植物陽離子載體——HKT家族在Na+、K+均衡過程中發(fā)揮重要作用。 目前認(rèn)為，植物HKT基因家族參與低鉀環(huán)境下植物鉀離子的吸收，并鑒定其功能為K+—Na+共轉(zhuǎn)運載體或Na+轉(zhuǎn)運載體。很多研究均表明HKT蛋白可提高植物耐鹽性。擬南芥AtHKT1是決定植物耐鹽的一個關(guān)鍵因子，參與根的Na+吸收。

3、而鹽芥是擬南芥的近親鹽生植物，與擬南芥極為相似，而且同樣具有作為遺傳模式植物的的形態(tài)和生長特性及遺傳特點。因此對鹽芥ThHKT1的功能、機(jī)理等方面研究有助于進(jìn)一步揭示鹽芥耐鹽性機(jī)制。 本研究主要包括以下幾方面內(nèi)容： 1.從鹽芥中克隆了與Na+、K+均衡相關(guān)的ThHKT1基因cDNA的全長序列。 2.鹽芥ThHKT1的過量表達(dá)研究其功能 1)分別使用35S啟動子和擬南芥AtHKT1基因的特異啟動子，將全長T

4、hHKT1基因連接到帶有Basta除草劑篩選標(biāo)記的植物表達(dá)載體pCAMBIA3301，從而構(gòu)建了兩個ThHKT1基因的表達(dá)載體：(1)35S啟動子：ThHKT1的過量表達(dá)載體；(2)AtHKT1啟動子：ThHKT1的表達(dá)載體。 2)將構(gòu)建好的35S啟動子：ThHKT1的過量表達(dá)載體和AtHKT1啟動子：ThHKT1的表達(dá)載體，通過農(nóng)桿菌分別轉(zhuǎn)化擬南芥sas2-1突變體(擬南芥EMS誘變)，實現(xiàn)擬南芥sas2-1即AtHKT1基因

5、的異源互補；0.2％ Basta除草劑篩選擬南芥轉(zhuǎn)基因株系；收獲種子(T0)后，自交一代得到足量的轉(zhuǎn)基因雜合種子(T1)；再次播種獲得ThHKT1轉(zhuǎn)基因純合子T2。 3)對所獲得的擬南芥轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)化純合子植株進(jìn)行以下分子鑒定和分析：(1)通過Basta基因的PCR擴(kuò)增，發(fā)現(xiàn)所有轉(zhuǎn)基因株系(共18株)均能擴(kuò)增出大約500bp的Basta基因的特異條帶，表明35S啟動子：ThHKT1的pCAMBIA3301過量表達(dá)載體己整合到擬南芥s

6、as2-1突變體的基因組；(2)不同濃度的KC1(0，50，100 mmol/L)分別處理擬南芥轉(zhuǎn)基因植株、野生型及sas2-1突變體，分別測定其植株地上部分和根的K+含量，結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因植株地上部和根中的K+含量均高于sas2-1突變體和野生型對照；(3)不同濃度NaCl(0，50，100mmol/L)分別處理擬南芥轉(zhuǎn)基因植株、野生型及sas2-1突變體，分別測定其植株地上部分和根的Na+含量，結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因植株和sas2-1地上

7、部分和根中的Na+含量相差不大，轉(zhuǎn)基因植株地上部分Na+含量高于野生型，根中則較野生型低。 3.鹽芥ThHKT1的基因沉默研究其功能 1)將鹽芥ThHKT1部分基因序列(340bp)構(gòu)建ThHKT1： pCAMBIA3301沉默載體，導(dǎo)入農(nóng)桿菌并進(jìn)行鹽芥的轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)基因純合子的篩選。 2)對所獲得的鹽芥轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)化純合子植株進(jìn)行以下分子鑒定和分析：(1)通過Basta基因的PCR擴(kuò)增，發(fā)現(xiàn)所有轉(zhuǎn)基因株系(共15株)均

8、能擴(kuò)增出大約500bp的Basta基因的特異條帶，表明ThHKT1：pCAMBIA3301沉默載體己整合到鹽芥基因組；(2)鹽芥轉(zhuǎn)基因株系的RT—PCR初步分析發(fā)現(xiàn)，部分轉(zhuǎn)基因株系ThHKT1表達(dá)水平與對照相比略有降低；(3)不同濃度的NaCl(O，200，400 mmol/L)分別處理鹽芥轉(zhuǎn)基因植株及野生型對照，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)基因植株長勢明顯弱于對照；分別測定其植株Na+、K+含量，結(jié)果表明200，400 mmol/LNaCl處理下轉(zhuǎn)基因