鹽芥ABI1和HKT1基因脅迫相關(guān)功能的研究.pdf

1、植物受到干旱、低溫和鹽等逆境境脅迫時，植物內(nèi)源 ABA濃度升高，環(huán)境信號通過一系列信使傳遞，并誘導多種基因轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后水平的改變，而 ABA信號傳導通路是一條重要的與脅迫應(yīng)答相關(guān)的信號傳導途徑，且植物激素 ABA在種子成熟萌發(fā)、植株生長發(fā)育和對逆境脅迫應(yīng)答中也有關(guān)鍵調(diào)控作用。
　　ABA信號通路作為一個復(fù)雜的磷酸化級聯(lián)反應(yīng)，涉及多種正、負調(diào)控因子。通過對擬南芥的分子遺傳學研究，已鑒定出多種 ABA信號傳導途徑的組分，包括蛋白激酶、

2、蛋白磷酸酶和多種轉(zhuǎn)錄因子等，其中Ser/Thr蛋白磷酸酶 PP2C家族成員在ABA信號轉(zhuǎn)導中作為負調(diào)控因子起重要作用。目前，植物中發(fā)現(xiàn)的多種 PP2C類磷酸酶均參與 ABA的信號傳導。
　　迄今為止，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)擬南芥 PP2C家族的成員如 ABI1、ABI2、HAB1、HAG3和PP2CA等，它們均為ABA信號途徑負調(diào)控因子，其中ABI1是ABA信號轉(zhuǎn)導途徑中的核心組分。它們通過改變 ABA信號的強弱調(diào)控植物的脅迫應(yīng)答，從而影響與

3、ABA信號傳導相關(guān)的植物表型和生理性狀，且認為ABI1基因的表達水平可影響植物的生長發(fā)育和抗逆性。
　　鹽芥是與擬南芥近緣的植物耐逆分子遺傳學研究模式系統(tǒng)。因此對鹽芥 ThABI1基因的克隆以及對其功能、機理等方面的研究有助于進一步深化對植物ABA信號途徑的認識，從而更好地理解鹽芥耐脅迫機理，為植物的耐逆性改良奠定基礎(chǔ)。
　　本研究主要包括以下幾方面內(nèi)容:
　　1.鹽芥 ThABI1基因 cDNA全長的克隆及序列分析。

4、
　　2.野生型鹽芥 ThABI1基因的耐逆研究:
　　干旱、鹽、冷和ABA處理野生型鹽芥后，實時定量 PCR檢測 ThABI1基因的表達水平，發(fā)現(xiàn)以上脅迫條件下 ThABI1基因的表達水平均有不同程度的上調(diào)。
　　3.過量表達鹽芥 ThABI1研究其功能:
　　ThABI1全長基因與帶有Basta篩選標記的植物表達載體 pCAMBIA3301連接，構(gòu)建35S∷ThABI1過量表達載體，并導入農(nóng)桿菌后進行鹽芥花序

5、侵染；0.2％Basta除草劑篩選鹽芥轉(zhuǎn)化子；對初篩的轉(zhuǎn)基因植株進行分子鑒定:PCR擴增其 Bar基因(500bp)，其中7株獲得 PCR陽性結(jié)果，說明35S∷ThABI1的pCAMBIA3301H過量表達載體已整合到野生型鹽芥的基因組。
　　4.鹽芥 ThABI1的基因沉默研究其功能:
　　將 ThABI1基因的部分序列(218bp)構(gòu)建 ThABI1∷pCAMBIA3301基因沉默表達載體；并導入農(nóng)桿菌后進行鹽芥花序侵染

6、；0.2％Basta除草劑篩選鹽芥轉(zhuǎn)化子。
　　對初篩的鹽芥轉(zhuǎn)基因植株進行分子鑒定:(1)PCR擴增其 Bar基因(500bp)，其中6株獲得 PCR陽性結(jié)果，說明 ThABI1∷pCAMBIA3301沉默載體已整合到鹽芥野生型的基因組；(2)鹽芥轉(zhuǎn)基因株系的實時定量 PCR分析發(fā)現(xiàn)，部分轉(zhuǎn)基因株系 ThABI1基因表達水平與野生型相比有不同程度的降低；(3)60μmol/LABA分別處理轉(zhuǎn)基因植株0、3和6小時后，實時定量 PC

7、R檢測 ThABI1基因的表達水平，結(jié)果表明轉(zhuǎn)基因植株中ABI1基因的表達水平受 ABA誘導上調(diào)。說明 ThABI1參與了植株對環(huán)境脅迫的響應(yīng)，且對干旱和外源 ABA誘導較敏感；ThABI1的進一步分子鑒定和功能研究仍在進行中。
　　5.擬南芥 AtHKT1啟動子∷ThHKT1轉(zhuǎn)基因植株的耐逆研究:
　　對擬南芥 AtHKT1啟動子∷ThHKT1轉(zhuǎn)基因純合子植株(宋開俠師姐獲得)進行以下分析:(1)0、75、125 mmol

8、/L不同濃度 NaCl分別處理擬南芥 HKT1突變體(sas2-1)、野生型和擬南芥轉(zhuǎn)基因植株，分別測定其植株的Na+、K+含量，結(jié)果表明較之于野生型，轉(zhuǎn)基因植株和sas2-1地上部分均積累更多 Na+，但 sas2-1表現(xiàn)更加明顯，說明鹽脅迫條件下AtHKT1啟動子∷ThHKT1的轉(zhuǎn)基因植株可減少 Na+轉(zhuǎn)運進入擬南芥 sas2-1地上部分；(2)0、50、100 mmol/L不同濃度 KCl分別處理擬南芥轉(zhuǎn)基因植株、野生型及sas2