鹽芥TsMT基因的克隆及鹽脅迫下的表達分析和根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)SsNHX1對大豆遺傳轉(zhuǎn)化的初步研究.pdf

1、鹽芥TSA47基因的克隆及鹽脅迫下的表達分析和根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)SsAHX對人豆遺傳轉(zhuǎn)化的初步研究鹽芥TsNT基因的克隆及鹽脅迫下的表達分析和根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)SsNHXI對大豆遺傳轉(zhuǎn)化的初步研究中文摘要土壤鹽漬化是影響農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和生態(tài)環(huán)境的一個非常重要的非生物脅迫因素，是現(xiàn)代生物科學(xué)迫切需要解決的問題。研究真鹽生植物的耐鹽機理、利用遺傳工程育種提高植物的耐鹽性已成為當前的研究熱點之一。鹽芥(Thellungiellasalsuginea)是一種

2、真鹽生植物，在進化中形成了特殊的耐鹽機制，能在含l00mMNaCl的土壤中正常完成生活史。許多研究表明，植物的耐鹽性常與其有效的抗氧化系統(tǒng)呈正相關(guān)，植物的抗氧化系統(tǒng)可分為酶促反應(yīng)系統(tǒng)和非酶促反應(yīng)系統(tǒng)。鹽生植物和甜土植物在活性氧的解毒機制上可能存在顯著的差異，因此從鹽芥中克隆活性氧清除蛋白的基因并分析其功能，有助于理解植物中鹽脅迫的耐受機制。金屬硫蛋白是一種鹽誘導(dǎo)表達蛋白，是很好的OH自由基清除蛋白，其清除能力主要來源于蛋白中處于還原態(tài)的

3、疏基。本實驗第一部分從用200mmol.LNaCl處理的鹽芥地上部分構(gòu)建的XZapcDNA文庫中克隆了編碼金屬硫蛋白的基因TsMT(GeneBank號為AF499726.1)，并分別對其序列特征、基因組結(jié)構(gòu)和在鹽脅迫下的表達特性進行了分析，結(jié)果表明Tsm7編碼鹽芥金屬硫蛋白，Southern結(jié)果顯示TSMl在鹽芥基因組中只有一個拷貝。用200mmol.L“NaCl處理鹽芥，隨時間延長，TSAR，基因在鹽芥中的表達量增加，在處理48h時表

4、達量最大。由實驗結(jié)果推測，TSM7，基因可能在保護鹽芥免受氧化損傷過程中起到‘定作用。鹽脅迫條件下，植物細胞滲透均衡和離子正常均衡狀態(tài)被破壞，特別是胞質(zhì)中過多的Na滲透調(diào)節(jié)對植物細胞的新陳代謝產(chǎn)生毒害，影響到植物細胞的調(diào)節(jié)機制。植物細胞適應(yīng)脅迫環(huán)境形成了一系列適應(yīng)機制，其中許多鹽生植物可通過Na外排、Na`區(qū)隔化或調(diào)整KNa比率保持細胞內(nèi)較低的Na濃度，消除Na‘的毒害，其中NaH‘反向轉(zhuǎn)運蛋白起著重要作用。大豆是公認的難轉(zhuǎn)化植物，利用

5、大豆子葉節(jié)再生系統(tǒng)及農(nóng)桿菌介導(dǎo)進行轉(zhuǎn)化是目前大豆轉(zhuǎn)基因的首選方法。本實驗第二部分通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將含NPT11和鹽地堿蓬Na丫『反向轉(zhuǎn)運蛋白基因(SsNH.Yl)的表達載體pROK2導(dǎo)入大豆子葉節(jié)中，經(jīng)過含Km的篩選培養(yǎng)基連續(xù)篩選，獲得了SsNHXI轉(zhuǎn)基因植株，篩選劑卡那霉素的適宜濃度是50mg.L。農(nóng)桿菌侵染時間和共培養(yǎng)時間對大豆的轉(zhuǎn)化有明顯的影響，侵染時間以15mi。為宜，共培養(yǎng)時間以3d為宜。在農(nóng)桿菌侵染和共培養(yǎng)階段的乙默丁香酮(

6、acetosyringaneAS)濃度和pH值對大豆轉(zhuǎn)化頻率有明顯的影響，AS的濃度為150umol.L，左右、pH值以5.2為宜。關(guān)鍵詞:鹽芥，金屬硫蛋白，大豆，分類號:Q78基因，根癌農(nóng)桿菌山東師范大學(xué)碩士論文鹽芥TSAR基因的克隆及鹽脅迫下的表達分析和根燕農(nóng)桿菌介導(dǎo)SNHXI對人豆遺傳轉(zhuǎn)化的初步研究stressandtheactivityofMTincreasedgraduallyinresponsetosaltstress.Th

7、eresultindicatesthatTAITmayplayanimportantrole〕nprotectingThellungiellasalsugineafromtheoxidationdamage.Themaladiescausedbysaltstressarisefromthedisruptionofcellularaqueousandionicequilibrium.Naaccumulatesexcessivelyinth

8、ecytoplasmcanbetoxictothemetabolismandaffectstheregulationmechanismoftheplantcell.Tocopewithsaltstressplantshavedevelopedavarietyofadaptationmechanisms.ThemechanismsofionhomeostasisofsomehalophytesincludeextrusingNaseque

9、steringNaintothevacuolarandregulatingtheratioofKNaandNa丫Hantiporterplaysanimportantroleintheseprocesses.Soybeanisagenerallyacknowledgedrecalcitrantcropfortransformation.Theregenerationsystemofsoybeancytoledonnode力andAgro

10、bacteriumrmediatedtransformationmethodisthefirstselectionatpresent.InthesecondpartofthisexperimenttheexpressionvectorpROK2containingNPT11andSsNHXJ(NaHantiporter)genefromsuaedasalsawasintroducedintosoybeancytoledonnodesby

11、genetransformationmediatedbyAgrobacteriumtumefaciens，andkanamycinresistanttransgenicplantswereobtainedbyscreeninginselectivecondition.Thesuitableconcentrationoftheselectiveagentkanamycinis50mg.L.Thedurationofinfectionand

12、coculturewithAgrobacteriuminfluencessoybeantransformationevidently.Thesuitableinfectiondurationisabout15minutesandtheappropriatecoculturedurationis3days.BoththeconcentrationofacetosyringaneandpHvalueatstagesofinfectionan

13、dcocultureinfluencethetransformationfrequencyofsoybean.ThesuitablepHvalueis5.2andtheoptimumconcentrationofacetosyringaneis150“moI.L.Keywords:ThellungiellasalsugineametallothioneinsoybeangeneAgrobacteriumtumefaciens山東師范大學(xué)