農(nóng)桿菌介導(dǎo)的南瓜耐鹽相關(guān)基因CmP5CS遺傳轉(zhuǎn)化菜用大豆.pdf

1、菜用大豆[Glycine max(L.)Mer.]營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，深受消費(fèi)者青睞。隨著市場(chǎng)需求的擴(kuò)大，其栽培面積正迅速增加。而土壤鹽漬化和次生鹽漬化的日益加劇，使菜用大豆的產(chǎn)量和品質(zhì)受到嚴(yán)重影響。本研究從耐鹽南瓜砧木品種中克隆了脯氨酸合成酶基因CmP5CS，并遺傳轉(zhuǎn)化菜用大豆，獲得轉(zhuǎn)基因植株。主要研究結(jié)果如下:
　　1.采用同源克隆法結(jié)合RT-PCR從南瓜砧木品種‘帝王新土佐，（Cucurbita maxima×C.moschata

2、cv.Shintosa Supreme）葉片中克隆出△1-吡咯啉-5-羧酸合成酶基因的編碼區(qū)序列，長(zhǎng)度為2，154bp，編碼717個(gè)氨基酸，命名為CmP5CS(GenBank登錄號(hào):JN606859)。與甜瓜P5CS核苷酸序列相似性為92.34％,該基因具有高等植物P5CS蛋白共有的結(jié)構(gòu)域與結(jié)合位點(diǎn):ATP結(jié)合位點(diǎn)、2個(gè)亮氨酸結(jié)構(gòu)域、NADPH結(jié)合位點(diǎn)、谷氨酰激酶(GK)結(jié)構(gòu)域和谷氨酸半醛(GSA)結(jié)構(gòu)域。
　　2.利用點(diǎn)突變和重

3、疊延伸PCR技術(shù)改變CmP5CS序列中特定位置堿基，消除目的基因內(nèi)部SacⅠ和XbaⅠ的酶切識(shí)別位點(diǎn)，將酶切及測(cè)序結(jié)果正確的CmP5CS基因定向插入到植物雙元表達(dá)載體pCMBIA3301的CaMV35啟動(dòng)子和NOS終止子中間，即成功構(gòu)建了CmP5CS基因抗除草劑植物表達(dá)載體pCMBIA3301-CmP5CSm，用凍融法將其轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌LBA4404。
　　3.比較了品種、基本培養(yǎng)基種類、植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)配比等因素對(duì)菜用大豆子葉節(jié)不定

4、芽再生率的影響。在B5+1mg·L-1TDZ+0.05mg·L-1NAA+5mg·L-1AgNO3的培養(yǎng)基上，6個(gè)菜用大豆品種的不定芽誘導(dǎo)率在53.5％到88.9％之間，其中‘理想95-1’，‘綠領(lǐng)1號(hào)’、‘綠領(lǐng)3號(hào)’的不定芽再生頻率分別達(dá)到88.9％，87.5％和83.3％，建立了菜用大豆高效不定芽再生技術(shù)體系。
　　4.探討了基因型、共培養(yǎng)條件和選擇壓等因素對(duì)菜用大豆子葉節(jié)遺傳轉(zhuǎn)化效率的影響。結(jié)果表明，農(nóng)桿菌侵染后，菜用大豆材

5、料‘NY-1001’的GUS瞬時(shí)表達(dá)率顯著高于其它15個(gè)品種。共培養(yǎng)基pH值為5.4，L-半胱氨酸(L-Cys)和乙酰丁香酮(AS)濃度分別為3mM和200μM時(shí)，‘NY-1001’的GUS瞬時(shí)表達(dá)率最高，三因素對(duì)該材料轉(zhuǎn)化效率影響的主次順序?yàn)?L-Cys＞pH值＞AS。共培養(yǎng)結(jié)束一周后加入篩選劑bialaphos，選擇壓力確定為4mg·L-1?？剐匝哭D(zhuǎn)入含有0.5mg·L-1GA3的伸長(zhǎng)培養(yǎng)基中誘導(dǎo)芽伸長(zhǎng)，在含有1mg·L-1IBA的