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1、陸生植物氣生器官的表面覆蓋著一層由蠟質(zhì)和角質(zhì)形成的脂膜,蠟質(zhì)主要由長(zhǎng)鏈?zhǔn)杷镔|(zhì)組成,這些物質(zhì)來(lái)源于含十六個(gè)碳或十八個(gè)碳的長(zhǎng)鏈脂肪酸延伸復(fù)合物。蠟質(zhì)在植物的表皮上結(jié)晶形成表皮蠟質(zhì),內(nèi)部的蠟質(zhì)與角質(zhì)等以聚合體形式存在,表皮蠟質(zhì)的功能包括調(diào)節(jié)表皮的滲透性、限制非氣孔性失水、防止紫外線(xiàn)的照射、抵抗細(xì)菌、真菌病原菌的入侵、阻止生殖后器官融合及花粉和雌蕊的相互作用等。角質(zhì)是構(gòu)成表皮細(xì)胞壁外保護(hù)層的主要的物質(zhì)。 對(duì)擬南芥進(jìn)行大規(guī)模功能基因組
2、學(xué)研究的過(guò)程中,分離到一個(gè)具有AP2結(jié)構(gòu)域的乙烯應(yīng)答型轉(zhuǎn)錄因子(ERF)—把這個(gè)轉(zhuǎn)錄因子稱(chēng)為WIN1(WAX INDUCER1)/SHN1(Atlg15360)。在擬南芥中過(guò)量表達(dá)WINI可提高參與蠟質(zhì)合成途徑中的基因的表達(dá)水平,從而顯著提高轉(zhuǎn)基因植物蠟質(zhì)的積累,引起營(yíng)養(yǎng)器官和生殖器官中角質(zhì)合成增加和成分改變,增強(qiáng)干旱耐性及表皮滲透性。反之,下調(diào)這個(gè)基因則能引起相反的結(jié)果。其同源基因SHN2及SHN3與WIN1的功能相似。 新
3、的耐鹽模式植物鹽芥與擬南芥近緣,在遺傳特征和生活習(xí)性上與擬南芥相似,如:小的基因組,短的生活史,都是自花授粉,有豐富的種子等:在cDNA水平上與擬南芥有大約90—95%的同源性。同時(shí),相比擬南芥,鹽芥又有很多自身的優(yōu)勢(shì)特點(diǎn),如有更強(qiáng)的耐受性和更為豐富的表皮蠟質(zhì)等。因此,鹽芥是一種很有前景的植物蠟質(zhì)研究材料。用基因組學(xué)方法研究鹽芥,可以鑒定和克隆在擬南芥中無(wú)明顯性狀的有價(jià)值的基因,特別是與植物表皮蠟質(zhì)合成有關(guān)的基因。 為了能更深
4、一步的研究WIN1基因的作用機(jī)理,我們以鹽生植物鹽芥為材料,從中克隆了其同源基因,分析了此基因的組織表達(dá)特異性,并構(gòu)建了基因沉默及過(guò)量表達(dá)載體,以分析此基因在鹽芥蠟質(zhì)及角質(zhì)代謝中的作用及與耐逆性的關(guān)系,主要工作總結(jié)如下: 1.鹽芥WINl cDNA的克隆及序列分析 根據(jù)GeneBank中已知的WIN1類(lèi)蛋白的cDNA和蛋白序列尋找保守區(qū)并合成簡(jiǎn)并引物,提取鹽芥花的mRNA并反轉(zhuǎn)錄成cDNA,以此作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增
5、,得到一條中間片段,經(jīng)過(guò)測(cè)序并進(jìn)行Blast分析,該片段與擬南芥WIN1的同源性較高。根據(jù)已有中間片段設(shè)計(jì)特異引物利用5’—RACE和3’—RACE分別合成其5’、3’端序列,最終得到WIN1同源基因—ThWIN1。ThWIN1的cDNA序列全長(zhǎng)846 bp,包括73 bp的5’—非編碼區(qū)和194bp的3’—非編碼區(qū)。開(kāi)放閱讀框?yàn)?79 bp,編碼192個(gè)氨基酸殘基,Blastx分析顯示ThWIN1氨基酸序列與擬南芥WIN1蛋白具有84
6、%的同源性。 2.ThWIN1的RT—PCR表達(dá)分析 提取鹽芥幼苗、葉、根、莖、花、角果總RNA,以?xún)?nèi)源Actin為內(nèi)標(biāo),設(shè)計(jì)特異引物通過(guò)半定量RT—PCR,研究了ThWIN1在鹽芥中的組織特異性表達(dá)。結(jié)果顯示ThWIN1在花中表達(dá)量最高,在莖和角果中也有表達(dá),在葉、幼苗、根中不表達(dá)或者表達(dá)量很低而沒(méi)有檢測(cè)到。 3.ThWIN1沉默載體的構(gòu)建 將ThWIN1基因的特異區(qū)段114 bp測(cè)序正確后酶切
7、連入pRT101i中間載體,用EcoR I和BamH I雙酶切重組質(zhì)粒pRT101i—ThWIN1,回收目的片段,連入同樣雙酶切的經(jīng)過(guò)改造的pCAMBIA—3301H載體(含有CaMV35S啟動(dòng)子),得到ThWIN1沉默表達(dá)載體pCAMBIA—3301H—Th WIN1。將沉默表達(dá)載體導(dǎo)入農(nóng)桿菌GV3101,PCR鑒定挑選陽(yáng)性克隆;花序浸染法進(jìn)行鹽芥的基因轉(zhuǎn)化,收獲了大量的種子;以除草劑Basta進(jìn)行其轉(zhuǎn)化子的篩選,獲得了14株ThWI
8、N1基因沉默構(gòu)建的鹽芥轉(zhuǎn)化子。目前已得到T1代種子。 4.ThWIN1過(guò)量表達(dá)載體的構(gòu)建 特異引物PCR多次測(cè)序正確后,將ThWIN1的開(kāi)放讀碼框用BamHI和PmlI酶切后連入同樣雙酶切的植物表達(dá)載體pCAMBIA—3301H中,構(gòu)建成除草劑(Basta)作為篩選標(biāo)記的植物過(guò)量表達(dá)載體pCAMBIA—3301H—ThWIN1。將過(guò)量表達(dá)載體導(dǎo)入農(nóng)桿菌GV3101,PCR鑒定挑選陽(yáng)性克??;花序浸染法進(jìn)行鹽芥的基因轉(zhuǎn)化
9、,目前已獲得T0代種子。 5.利用酵母雙雜交系統(tǒng)研究與ThWIN1轉(zhuǎn)錄因子相互作用的蛋白 大量法高質(zhì)量提取鹽芥花總RNA,純化mRNA,構(gòu)建鹽芥cDNA文庫(kù),以ThWIN1為誘餌蛋白,利用酵母雙雜交體系研究與ThWIN1轉(zhuǎn)錄因子相互作用的蛋白。目前已純化了高質(zhì)量的mRNA,后續(xù)工作正在進(jìn)行。 本論文主要?jiǎng)?chuàng)新點(diǎn): 1、首次從鹽芥中克隆了ThWINI基因,并對(duì)核苷酸、氨基酸序列進(jìn)行了分析。
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