水稻MGD同源基因的克隆及功能研究.pdf

1、高等植物中，單半乳糖甘油二酯(MGDG)和雙半乳糖甘油二酯(DGDG)是組成葉綠體中光合膜的主要膜脂類型，其中MGDG是DGDG合成的前體，因而MGDG的合成在植物的正常生長發(fā)育中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。單半乳糖甘油二酯合成酶(MGD)是合成MGDG的關(guān)鍵酶。目前對MGD的研究多集中在雙子葉植物尤其是模式植物擬南芥，而對單子葉植物中MGD的類型和功能研究相對較少。為了研究單子葉植物中MGD的類型以及功能，本研究以單子葉模式植物粳稻品種日本

2、晴為研究材料，通過RACE法分離并克隆出三個(gè)OsMGD基因，通過生物信息學(xué)軟件對OsMGD同源基因的類型、亞細(xì)胞定位以及功能進(jìn)行初步預(yù)測分析，并構(gòu)建過表達(dá)載體轉(zhuǎn)入煙草來研究水稻MGD同源基因在植株生長以及低磷脅迫下的功能和作用機(jī)制。主要獲得以下結(jié)果:
　　(1)通過NCBI數(shù)據(jù)庫中在線工具Blast，利用擬南芥以及秈稻中的MGD基因序列，在粳稻品種日本晴中，共Blast到三個(gè)MGD基因的部分序列，通過RACE法分離并克隆這三個(gè)Os

3、MGD基因，分別為OsMGD/02g、OsMGD/08g、OsMGD/09g。通過對多種植物中MGD氨基酸序列進(jìn)行比對，并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，發(fā)現(xiàn)OsMGD/02g與擬南芥MGD2和MGD3在同一進(jìn)化分枝，則OsMGD/02g初步預(yù)測為Type B型MGD;OsMGD/09g則與擬南芥MGD1在同一進(jìn)化分枝，初步預(yù)測為Type A型MGD;而OsMGD/08g隸屬另一進(jìn)化分枝，與上述兩種Type類型的進(jìn)化距離較遠(yuǎn)，且此進(jìn)化分枝中均為單子葉植

4、物MGD，因此初步推測OsMGD/08g隸屬于單子葉植物特有的新類型MGD。另外通過生物信息學(xué)軟件分別對三個(gè)OsMGD的跨膜結(jié)構(gòu)、亞細(xì)胞定位以及啟動(dòng)子區(qū)順式作用元件進(jìn)行預(yù)測分析，發(fā)現(xiàn)這三個(gè)OsMGD蛋白都是親水性蛋白，且均不含有跨膜區(qū)域，OsMGD/02g和OsMGD/09g定位于葉綠體，而OsMGD/08g定位于線粒體。分析這三個(gè)OsMGD基因啟動(dòng)子順式作用元件發(fā)現(xiàn)這三個(gè)基因啟動(dòng)子區(qū)均存在與逆境脅迫相關(guān)的順式作用元件。
　　(2

5、)利用半定量RT-PCR分別檢測三個(gè)OsMGD基因在不同水稻組織中的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)OsMGD/02g和OsMGD/09g均在葉和莖中表達(dá)量較高，在根和花中表達(dá)量較低;而OsMGD/08g則是在葉、根、莖、花中的表達(dá)量都很低。隨后對這三個(gè)基因在低磷脅迫、干旱脅迫以及鹽脅迫下葉和根中的表達(dá)量進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)無論在低磷脅迫、干旱脅迫還是鹽脅迫時(shí)，葉中OsMGD/02g表達(dá)量都是先升高后降低，根中OsMGD/02g的表達(dá)量則是持續(xù)升高;而OsMGD/

6、08g只有在低磷脅迫時(shí)會(huì)強(qiáng)烈誘導(dǎo)表達(dá);在水稻葉中，OsMGD/09g在不同的脅迫下表達(dá)量變化不同，而在水稻根中，OsMGD/09g的表達(dá)并不受這三種脅迫影響。通過對三個(gè)OsMGD在不同組織以及不同逆境脅迫下的表達(dá)模式分析，初步證實(shí)系統(tǒng)進(jìn)化樹對這三個(gè)OsMGD的Type分類。
　　(3)利用Gateway法構(gòu)建三個(gè)OsMGD基因的植物表達(dá)載體，并通過葉盤法完成煙草轉(zhuǎn)化工作。通過潮霉素的篩選，轉(zhuǎn)基因煙草幼苗基因組DNA的PCR檢測，以

7、及定量qRT-PCR檢測目的基因的表達(dá)，各篩選3個(gè)轉(zhuǎn)基因煙草株系，結(jié)合野生型煙草進(jìn)行盆栽實(shí)驗(yàn)對轉(zhuǎn)基因煙草進(jìn)行表型分析。在正常條件下與野生型煙草相比，不同OsMGD基因超表達(dá)均提高了煙草中的葉綠素含量和類胡蘿卜素含量，增強(qiáng)了凈光合速率，進(jìn)而增加了轉(zhuǎn)基因煙草的生長速率，提高了煙草的葉鮮重，從而使得轉(zhuǎn)OsMGD煙草的長勢較好。
　　(4)為了研究OsMGD同源基因在低磷脅迫下的功能和作用機(jī)制，通過盆栽實(shí)驗(yàn)，對轉(zhuǎn)基因和野生型煙草進(jìn)行低磷脅

8、迫處理。與野生型煙草相比，低磷處理后三個(gè)OsMGD基因超表達(dá)煙草老葉上的壞死斑明顯較少且沒有野生型煙草壞死斑嚴(yán)重，而且轉(zhuǎn)基因煙草在低磷脅迫下的葉綠素含量、凈光合速率均顯著高于野生型煙草，葉綠素?zé)晒鈪?shù)Fv/Fm、ΦPSⅡ以及ETR在轉(zhuǎn)基因煙草中的下降幅度相較與野生型SR1較小，說明OsMGD同源基因超表達(dá)后緩解了低磷脅迫對煙草植株的傷害，轉(zhuǎn)基因煙草的耐低磷能力提高。
　　(5)利用氣相色譜對低磷脅迫下煙草老葉中脂質(zhì)組分進(jìn)行測定，發(fā)

9、現(xiàn)低磷處理后，與野生型煙草相比，轉(zhuǎn)基因煙草中MGDG含量均顯著高于野生型SR1，且轉(zhuǎn)基因煙草中DGDG的上升幅度更大，說明低磷脅迫下，OsMGD同源基因超表達(dá)煙草中增強(qiáng)了MGDG和DGDG的合成。本研究中低磷處理后野生型煙草和轉(zhuǎn)基因煙草中的磷脂含量均顯著降低，但在低磷脅迫下，相對于野生型SR1，轉(zhuǎn)基因煙草中磷脂的下降幅度更小。另外，計(jì)算GL/PL以及DGDG/MGDG的比值后發(fā)現(xiàn)，超表達(dá)OsMGD同源基因煙草在低磷脅迫下具有較高的GL/

10、PL和DGDG/MGDG，表明有更多的可以形成雙層膜的DGDG轉(zhuǎn)移到質(zhì)體外膜來替代缺失的磷脂，從而維持膜的完整性和穩(wěn)定性。因此，通過調(diào)控半乳糖脂的合成能力加強(qiáng)了低磷脅迫下的脂質(zhì)重塑，然后維持膜結(jié)構(gòu)的完整以及穩(wěn)定，進(jìn)而維持葉綠體以及其他亞細(xì)胞器的結(jié)構(gòu)和功能，緩解低磷脅迫對植物造成的傷害，從而提高植物對低磷脅迫的抗性。
　　(6)通過比較OsMGD/02g、OsMGD/08g以及OsMGD/09g基因超表達(dá)煙草在低磷脅迫下的生理指標(biāo)以

11、及脂質(zhì)組分變化，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)OsMGD/08g基因煙草對低磷脅迫的耐受性更強(qiáng)，其次是轉(zhuǎn)OsMGD/02g基因煙草。OsMGD/08g可能是在長時(shí)間低磷脅迫時(shí)發(fā)揮作用，且很可能是低磷脅迫誘導(dǎo)OsMGD/08g基因表達(dá)后直接在線粒體膜上利用磷脂降解代謝物二?；视王?DAG)作為底物催化合成MGDG，并通過線粒體上可能存在的雙半乳糖甘油二酯合成酶(DGD)合成DGDG，直接在線粒體膜上替代減少的磷酯，從而維持膜的完整性和穩(wěn)定性。而預(yù)測為Type