棉花ERF亞族轉(zhuǎn)錄因子基因的克隆與特征分析.pdf

1、目的：海島棉又名長絨棉，其纖維細(xì)長、富有光澤、強(qiáng)力較高，是紡制高檔和特種棉紡織品的重要原料，在我國新疆是其唯一產(chǎn)區(qū)。但近年來海島棉枯萎病的危害卻未得到良好控制，病害仍在逐年的擴(kuò)大且加重。由于海島棉抗枯萎病基因資源匱乏，傳統(tǒng)遠(yuǎn)緣雜交育種方法又存在后代分離大、穩(wěn)定慢等缺點，致使海島棉抗枯萎病品種的選育工作進(jìn)展緩慢。ERF亞族轉(zhuǎn)錄因子是植物特有的一類轉(zhuǎn)錄因子，它們通過與GCC-box等順式作用元件互作激活或抑制下游防衛(wèi)基因的表達(dá)，改變植物抗病

2、性。因此，本研究旨在從枯萎病抗性基因豐富的陸地棉品種中篩選并克隆與抗枯萎病相關(guān)的ERF亞族轉(zhuǎn)錄因子基因，為利用基因工程技術(shù)培育海島棉抗枯萎病品種提供新的基因資源和理論基礎(chǔ)。
　　方法：本研究以高抗枯萎病的陸地棉品種“中棉所12”為實驗材料；以擬南芥ERF-B3亞組轉(zhuǎn)錄因子的AP2/ERF結(jié)構(gòu)域為探針，利用NCBI中的棉花Gossypium hirsutum EST數(shù)據(jù)庫進(jìn)行電子克?。话攵縍T-PCR分析克隆基因在枯萎病菌處理后不

3、同時間點的表達(dá)情況；結(jié)合RT-PCR技術(shù)篩選并克隆與抗枯萎病相關(guān)的ERF-B3亞組轉(zhuǎn)錄因子基因GhB301；利用實時熒光定量PCR分析該基因在棉花枯萎病菌、ET、SA、干旱、高鹽與低溫脅迫下的表達(dá)模式；構(gòu)建相應(yīng)的植物過表達(dá)載體轉(zhuǎn)化煙草，初步探索其功能。
　　結(jié)果：⑴利用NCBI中相關(guān)數(shù)據(jù)庫信息和軟件，通過電子克隆結(jié)合RT-PCR技術(shù)，從陸地棉中擴(kuò)增出15個B3亞組基因的特異片段；半定量RT-PCR分析發(fā)現(xiàn)，GhB301、GhB30

4、2、GhB305與GhB307等4個基因響應(yīng)枯萎病菌誘導(dǎo)，其中GhB301基因的應(yīng)答最為強(qiáng)烈；⑵利用RT-PCR技術(shù)從高抗枯萎病品種“中棉所12”根中克隆了一個新的與抗枯萎病相關(guān)的ERF-B3亞組轉(zhuǎn)錄因子基因GhB301(基因登錄號KC222015)；序列分析表明，該基因cDNA全長593bp，開放閱讀框384bp，編碼127個氨基酸，含有一個保守的AP2/ERF結(jié)構(gòu)域；⑶qPCR分析顯示：枯萎病菌誘導(dǎo)后，GhB301基因在抗病品種根中

5、表達(dá)量的增加顯著高于感病品種，其表達(dá)量達(dá)到峰值的時間也早于感病品種；在根中的表達(dá)量明顯高于莖和葉且較莖與葉早表達(dá)；ET和SA均可誘導(dǎo)GhB301基因表達(dá)，但該基因?qū)T處理的響應(yīng)較SA持久；此外，該基因的表達(dá)水平還受低溫、干旱和高鹽的誘導(dǎo)，且對低溫誘導(dǎo)的響應(yīng)更為明顯；⑷生物信息學(xué)分析表明，GhB301基因編碼的蛋白可能為一親水蛋白，無跨膜區(qū)和信號肽，二級結(jié)構(gòu)的主要組成元件為α螺旋與無規(guī)則卷曲，典型的AP2/ERF結(jié)構(gòu)域位于第18-76氨

6、基酸之間，定位于細(xì)胞核中的可能性最大；⑸構(gòu)建GhB301基因植物過表達(dá)載體，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法進(jìn)行煙草遺傳轉(zhuǎn)化；經(jīng)PCR檢測，獲得13株轉(zhuǎn)基因陽性植株；與野生型煙草相比，轉(zhuǎn)基因煙草植株表型無明顯改變，但病程相關(guān)蛋白基因PR1與PR2的表達(dá)水平明顯高于野生型。
　　結(jié)論：GhB301是一個新的與抗枯萎病相關(guān)的ERF-B3亞組轉(zhuǎn)錄因子基因；它參與了棉花對病原菌、激素及非生物脅迫的應(yīng)答反應(yīng)；能在煙草中異位表達(dá)并能激活相關(guān)病程相關(guān)蛋白基因的