蘿卜RsMYB28和RsMYB29轉(zhuǎn)錄因子基因克隆與表達(dá)特征分析.pdf

1、蘿卜(Raphanus sativus L.)是一種重要的十字花科根菜類作物，具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，在中國(guó)乃至世界都有廣泛種植。硫代葡萄糖苷是一種重要的植物次生代謝產(chǎn)物，主要存在于蘿卜等十字花科植物中。硫苷及其降解產(chǎn)物在植物防御、風(fēng)味形成以及人類癌癥預(yù)防中起重要的作用，此外，它還具有作為生物農(nóng)藥的潛力。MYB轉(zhuǎn)錄因子MYB28、MYB29、MYB76等是硫苷生物合成過(guò)程中的關(guān)鍵調(diào)控基因，其表達(dá)量的多少直接影響蘿卜中硫苷的含量和分布。調(diào)控基

2、因的某些特性在擬南芥、花椰菜、芥菜、小白菜、大白菜等十字花科作物已有廣泛研究，然而在蘿卜研究領(lǐng)域關(guān)于MYB28和MYB29的分子特性、表達(dá)特征尚未見(jiàn)報(bào)道。因此，本論文以蘿卜品種‘NAU-ZQH’為材料，通過(guò)比對(duì)擬南芥中MYB28和MYB29的序列與本實(shí)驗(yàn)室蘿卜轉(zhuǎn)錄組序列，克隆蘿卜中調(diào)控硫苷合成的兩個(gè)關(guān)鍵基因RsMYB28和RsMYB29，之后從亞細(xì)胞定位、轉(zhuǎn)錄激活活性和表達(dá)特征等多方面進(jìn)行研究，以期，增加對(duì)蘿卜中RsMYB28和RsMY

3、B29基因分子特性和表達(dá)特征的認(rèn)識(shí)，為后期通過(guò)基因改良培育出硫苷含量較高的蘿卜新品種提供理論基礎(chǔ)。本研究主要結(jié)果如下:
　　1.通過(guò)比對(duì)，對(duì)擬南芥中MYB28和MYB29的序列以及參照本實(shí)驗(yàn)室蘿卜轉(zhuǎn)錄組序列設(shè)計(jì)出兩對(duì)特異引物RsMYB28F1/R1和RsMYB29F1/R1，從蘿卜中分離得到RsMYB28和RsMYB29的DNA和cDNA全長(zhǎng)。其中RsMYB28基因組DNA和cDNA全長(zhǎng)分別為1836 bp和1614 bp，包括1

4、092 bp的開(kāi)放閱讀框(ORE)，編碼363個(gè)氨基酸。RsMYB29基因組DNA全長(zhǎng)1493 bp，包含3個(gè)外顯子和2個(gè)內(nèi)含子，cDNA全長(zhǎng)1093 bp，包括1023bp的開(kāi)放閱讀框(ORF)，編碼340個(gè)氨基酸。蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)顯示兩個(gè)基因都含有典型的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域。序列比對(duì)及進(jìn)化樹(shù)分析表明，RsMYB28和RsMYB29都與芥菜和甘藍(lán)在同一分支上，且與白菜和擬南芥具有較高同源性。同時(shí)利用染色體步移法克隆這兩個(gè)MYB基因的啟動(dòng)子序

5、列，得到的RsMYB28基因5'側(cè)翼序列1257 bp，RsMYB29基因5'側(cè)翼序列576 bp。啟動(dòng)子元件分析顯示，RsMYB28和RsMYB29基因啟動(dòng)子序列包含多個(gè)光應(yīng)答相關(guān)元件，此外RsMYB28基因啟動(dòng)子還具有乙烯、赤霉素、干旱、抵御和脅迫響應(yīng)相關(guān)的逆境脅迫響應(yīng)元件，RsMYB29基因啟動(dòng)子還含有干旱、水楊酸生物鐘等響應(yīng)元件。
　　2.利用qRT-PCR技術(shù)對(duì)兩個(gè)基因進(jìn)行表達(dá)分析顯示，RsMYB28和RsMYB29基因

6、的轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平在種子和膨大前期表達(dá)量最高，膨大盛期表達(dá)量最小，RsMYB28基因表達(dá)量較大的部位為莖和葉片。RsMYB29基因除了膨大盛期，表達(dá)量較大的部位為根和葉片。不同處理下的表達(dá)特性分析顯示，創(chuàng)傷、葡萄糖和ABA處理促進(jìn)RsMYB28基因的表達(dá)，RsMYB29基因的在創(chuàng)傷、MeJA和葡萄糖處理后表達(dá)量增加。同時(shí)構(gòu)建了過(guò)表達(dá)載體pCAMBIA1301-RsMYB28和pCAMBIA1301-RsMYB29，并成功轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌。

7、　　3.構(gòu)建載體pGBKT7-RsMYB28和pGBKT7-RsMYB29，轉(zhuǎn)化至酵母菌株Y2H，接種于SD/-Trp培養(yǎng)基培養(yǎng)。最后分別接種于SD/-His-Ade和SD/X-α-gal培養(yǎng)基中觀察酵母生長(zhǎng)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)含有pGBKT7-RsMYB28和pGBKT7-RsMYB29質(zhì)粒的菌株能正常生長(zhǎng)并在SD/ X-α-gal培養(yǎng)基中顯示藍(lán)色，說(shuō)明RsMYB28和RsMYB29在酵母中具有轉(zhuǎn)錄激活活性。構(gòu)建綠色熒光蛋白融合載體，通過(guò)基