番茄SlNAM1轉錄因子的分離與功能分析.pdf

1、低溫是植物地理分布和農業(yè)生產的重要限制因素，低溫脅迫包括冷害（<10℃）和凍害（<0℃）兩種。低溫能夠直接抑制植物正常的生理代謝，造成植物生長發(fā)育的延緩或阻滯；低溫導致光合速率下降，光合作用產物的形成、分配及轉運均受到影響；低溫會抑制水分的吸收，誘導產生次生的脫水和滲透脅迫；同時，低溫還會誘導產生大量的活性氧（reactive oxygen species，ROS），對生物大分子及細胞膜結構造成破壞。番茄等喜溫蔬菜經歷低溫時，自身不能完

2、成冷馴化（Cold acclimation），因此其農業(yè)生產易受低溫的影響。
　　NAC轉錄因子是植物特有的轉錄因子家族。大多數NAC轉錄因子都是誘導表達型的，在植物不同發(fā)育階段以及非生物脅迫和生物脅迫的響應過程中均發(fā)揮重要作用。番茄中的NAC轉錄因子多達102個，但功能大部分是未知的。本實驗從番茄中分離得到了一個NAC轉錄因子（SlNAM1），并以過表達 SlNAM1的轉基因煙草為材料，研究了SlNAM1對煙草低溫抗性的影響，對

3、于闡明NAC轉錄因子參與植物低溫響應的機制具有十分重要的科學意義。本研究主要結果如下：
　　（1）根據NCBI中已知的SlNAM1基因序列（GenBank注冊號：NM_001247290），利用DNAMAN設計特異引物，以番茄cDNA為模板，利用PCR反應獲得SlNAM1全長。SlNAM1基因全長1218bp，開放閱讀框長891bp，編碼296個氨基酸。
　　（2）在煙草中瞬時表達和穩(wěn)定表達SlNAM1-GFP融合蛋白產物，

4、并利用激光共聚焦顯微鏡和熒光顯微鏡進行觀察，發(fā)現綠色熒光只存在于細胞核中，說明SlNAM1定位于細胞核；利用酵母雙雜交系統(tǒng)檢測 SlNAM1的轉錄激活活性，發(fā)現其 C端具有轉錄激活活性，說明SlNAM1作為轉錄因子行使功能。
　　（3）通過實時熒光定量 PCR（qRT-PCR）對 SlNAM1在番茄中的表達模式進行了分析，發(fā)現該基因表達受4℃、PEG、NaCl、ABA和MeJA等多種脅迫和激素處理的誘導；組織特異性表達分析結果表明

5、SlNAM1在葉片中表達量最高。
　　（4）構建pBI121-SlNAM1真核表達載體，利用農桿菌介導的葉盤法轉化煙草，獲得過表達SlNAM1的轉基因煙草，利用PCR、qRT-PCR篩選得到轉基因煙草，并選取OE-7、OE-10和OE-10進行后續(xù)實驗。
　　（5）正常條件下，轉基因煙草與野生型煙草生長情況一致，并能正常的開花結籽。低溫脅迫下，與野生型煙草相比，轉基因煙草具有更高的種子萌發(fā)率、較低的失水萎蔫程度和更高的凈光合

6、速率。
　?。?）低溫脅迫下，煙草體內的活性氧積累急劇上升。與野生型煙草相比，轉基因植株活性氧積累量明顯較低，SOD和APX等抗氧化酶活性均高于野生型煙草；利用qRT-PCR對抗氧化酶合成關鍵基因的表達量進行分析，發(fā)現低溫脅迫下轉基因植株中的抗氧化酶表達量上調程度高于野生型，因此，我們認為轉基因煙草通過上調抗氧化酶的合成來維持較高的抗氧化酶活性。同時，低溫脅迫下，煙草中MDA含量和REL上升，細胞膜穩(wěn)定性下降。與野生型煙草相比，轉