番茄LeNLP4轉(zhuǎn)錄因子的功能分析.pdf

1、NAC(NAM, ATAF1/2，CUC2)轉(zhuǎn)錄因子是近十幾年來(lái)新發(fā)現(xiàn)的植物所特有的轉(zhuǎn)錄因子，構(gòu)成了最大的轉(zhuǎn)錄因子家族之一。NAC作為轉(zhuǎn)錄因子起激活或抑制應(yīng)答的功能，主要涉及頂端分生組織的形成，次生細(xì)胞壁的形成，側(cè)根的發(fā)育，胚胎的發(fā)育，植物的衰老以及植物對(duì)生物和非生物脅迫反應(yīng)等。因此，開(kāi)展LeNLP4的功能研究對(duì)番茄根系發(fā)育和NAC轉(zhuǎn)錄因子的抗逆性有非常重要的作用。
　　本研究從番茄葉片中克隆到一個(gè)NAC轉(zhuǎn)錄因子LeNLP4，過(guò)表

2、達(dá)該基因促進(jìn)了番茄植株根系的發(fā)育，并且提高了轉(zhuǎn)基因番茄植株的耐冷性及轉(zhuǎn)基因煙草植株的耐熱性。主要結(jié)果如下:
　　(1)通過(guò)NCBI查得該基因的全長(zhǎng)mRNA序列，設(shè)計(jì)特異引物，利用RT-PCR的方法獲得該基因的全長(zhǎng)cDNA。LeNLP4全長(zhǎng)1595bp，開(kāi)放閱讀框1218bp，編碼406個(gè)氨基酸，N-端具有保守的NAC結(jié)構(gòu)域，C-端為轉(zhuǎn)錄激活區(qū)。qRT-PCR結(jié)果表明，LeNLP4在根中表達(dá)量最高，其次是花和果實(shí)。同時(shí)，該基因的轉(zhuǎn)錄

3、物受低溫、高溫、鹽、干旱以及激素誘導(dǎo)。
　　(2)將LeNLP4∷GFP融合蛋白在洋蔥表皮細(xì)胞中瞬時(shí)表達(dá)，利用激光共聚焦顯微鏡觀察到該融合蛋白定位于細(xì)胞核中。
　　(3)構(gòu)建了原核表達(dá)載體pET-LeNLP4，用IPTG誘導(dǎo)其在大腸桿菌BL21中表達(dá)，將誘導(dǎo)的蛋白純化后免疫小鼠，制備抗體，測(cè)得效價(jià)為1∶100，000。Western雜交表明，過(guò)表達(dá)株系中LeNLP4蛋白的表達(dá)量增加。
　　(4)將LeNLP4的編碼區(qū)與

4、pBI121載體重組，成功構(gòu)建了過(guò)表達(dá)載體和反義表達(dá)載體，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤法轉(zhuǎn)化番茄，通過(guò)PCR、qRT-PCR和Western雜交檢測(cè)具有卡那抗性的轉(zhuǎn)基因植株，結(jié)果表明獲得了過(guò)表達(dá)LeNLP4的轉(zhuǎn)基因番茄植株和反義抑制LeNLP4表達(dá)的轉(zhuǎn)基因小苗，后者影響頂端分生組織發(fā)育而死亡。與野生型(WT)相比，過(guò)表達(dá)株系根的長(zhǎng)度增長(zhǎng)，干重增加。
　　(5)與WT植株相比，在低溫(4℃)脅迫下轉(zhuǎn)基因番茄植株具有較高的生長(zhǎng)量和光系統(tǒng)Ⅱ最大

5、光化學(xué)效率(PSⅡ，F(xiàn)v/Fm)，過(guò)氧化氫(H2O2)和超氧陰離子(O2·-)清除速率，抗壞血酸過(guò)氧化物酶(APX)和超氧化物歧化酶(SOD)活性，以及較低的丙二醛(MDA)含量和相對(duì)電導(dǎo)率(REC)。過(guò)表達(dá)株系中CBF1的表達(dá)高于WT。上述結(jié)果表明，LeNLP4轉(zhuǎn)錄因子的過(guò)表達(dá)提高了轉(zhuǎn)基因番茄抗低溫脅迫能力。
　　(6)獲得轉(zhuǎn)基因煙草，與WT植株相比，在高溫(42℃)脅迫下轉(zhuǎn)基因煙草植株具有較高Fv/Fm，H2O2和O2·-清除