象草MYB4轉(zhuǎn)錄因子及CCR啟動子的克隆與功能分析.pdf

1、象草（Pennisetum purpureum）是一種禾本科狼尾草屬多年生草本植物，是熱帶和亞熱帶地區(qū)的重要種質(zhì)資源。但植株體內(nèi)高含量的木質(zhì)素限制了象草的開發(fā)和利用。因此，通過基因工程的手段，對植株進行木質(zhì)化遺傳改良對象草的利用具有非常重要的意義。MYB轉(zhuǎn)錄因子可以在轉(zhuǎn)錄水平上參與木質(zhì)素的合成調(diào)控。本研究克隆了象草MYB轉(zhuǎn)錄因子，并且對其進行了功能分析，同時還克隆了肉桂酰輔酶A還原酶基因（Cinnamoy-CoA Reductase,C

2、CR）啟動子，分析了其表達(dá)特性，以期為象草的木質(zhì)化改良工作奠定基礎(chǔ)。主要的研究結(jié)果如下：
　?。?）通過同源克隆的技術(shù)，從華南象草中克隆出一個756 bpMYB轉(zhuǎn)錄因子CDS區(qū)域，命名為PpMYB4。序列已經(jīng)提交GenBank，登錄號為：KU612217。
　　（2）通過軟件分析，PpMYB4含有251個氨基酸，蛋白質(zhì)分子式為C1217H1954N362O356S17?？偡肿恿繛?7.89KDa，理論等電點（PI）為8.81

3、。不穩(wěn)定系數(shù)是45.45，屬于不穩(wěn)定蛋白，親水性平均值（GRAVY）為-0.468，為親水性蛋白，定位于細(xì)胞核中。PpMYB4的氨基酸序列中含有2個保守的結(jié)構(gòu)域，在系統(tǒng)進化樹中與單子葉植物R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子歸為一類。
　?。?）構(gòu)建一個以eGFP為報告基因的亞細(xì)胞定位載體pAN580-PpMYB4，通過PEG介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化象草原生質(zhì)體后發(fā)現(xiàn)PpMYB4定位于細(xì)胞核中。
　?。?）構(gòu)建了PpMYB4的植物過表達(dá)載體pBA-P

4、pMYB4，并且通過葉盤法轉(zhuǎn)化煙草，最終得到7株陽性轉(zhuǎn)基因株系。與野生型相比，轉(zhuǎn)基因植株生長緩慢，出現(xiàn)矮化、莖節(jié)變短、老葉早衰、葉形不正常等現(xiàn)象。轉(zhuǎn)基因煙草莖部的木質(zhì)素含量與野生型植株相比顯著下降，其中OE6植株的木質(zhì)素含量比野生型植株木質(zhì)素含量低32.45％。該結(jié)果說明PpMYB4基因參與了木質(zhì)素合成的負(fù)調(diào)控。
　?。?）對轉(zhuǎn)基因植株木質(zhì)素合成途徑中關(guān)鍵酶基因進行Real-time PCR檢測，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植株的木質(zhì)素合成關(guān)鍵酶基

5、因PAL、C4H、CAD、CCoAOMT、HCT的相對表達(dá)量分別為0.49、0.38、0.71、0.30、0.45，比野生型植株表達(dá)量低，且PAL、C4H和CAD表達(dá)量顯著低于野生型植株。該結(jié)果說明過量表達(dá) PpMYB4使得植株的木質(zhì)素合成關(guān)鍵酶基因的改變從而引起植株木質(zhì)素含量的改變。
　?。?）通過hiTAIL-PCR的方法克隆了華南象草PpCCR基因起始密碼子ATG上游1368 bp的啟動子序列。經(jīng)過預(yù)測，該序列的轉(zhuǎn)錄起始位點

6、（TSS）為T，位于ATG上游261 bp處。PpCCR啟動子含有重要的順式作用元件TATA-box和CAAT-box。PpCCR啟動子的其他順式作用元件還可以分為3類。一類是對植物生長發(fā)育相關(guān)的元件，如光響應(yīng)元件、分生組織表達(dá)相關(guān)的元件（CAT-box）、胚乳表達(dá)相關(guān)的元件（GCN4_motif）、植物生物鐘調(diào)控的作用元件（Circadian）。另外一類主要是對外源激素脅迫響應(yīng)的元件，如 CGTCA-motif、TGACG-motif

7、為茉莉酸甲酯響應(yīng)的元件，TGA-element為生長素響應(yīng)的元件，motif IIb為脫落酸的響應(yīng)元件。還有一類調(diào)控元件為MYB轉(zhuǎn)錄因子的識別位點。
　?。?）構(gòu)建PpCCR啟動子-GUS表達(dá)載體并且通過葉盤法轉(zhuǎn)化煙草。對轉(zhuǎn)基因植株莖、葉柄、葉和根進行 GUS組織化學(xué)染色發(fā)現(xiàn)，植株葉柄的木質(zhì)部和韌皮部以及莖部的維管組織細(xì)胞能被染成藍(lán)色；葉片和根部不能染成藍(lán)色。以上結(jié)果說明PpCCR啟動子是一個典型的維管組織特異型啟動子。利用200