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文檔簡介
1、種子能否順利出土萌發(fā)直接關(guān)系到農(nóng)業(yè)生產(chǎn)是否獲得豐收,研究種子萌發(fā)性狀對促進農(nóng)業(yè)生產(chǎn)具有重要意義。為探討玉米MYB轉(zhuǎn)錄因子基因Zm MYB59在種子萌發(fā)中的功能,前期構(gòu)建pCAMBIA3301-ZmMYB59-Bar植物過表達載體轉(zhuǎn)化煙草,并分析了ZmMYB59基因在不同播深及萌發(fā)過程中的表達情況。本文通過構(gòu)建植物表達載體,經(jīng)轉(zhuǎn)化和鑒定獲得陽性轉(zhuǎn)基因水稻植株,對ZmMYB9基因的啟動子功能進行了鑒定;對ZmMYB59基因表達的蛋白進行了定
2、位;對ZmMYB59轉(zhuǎn)基因煙草T2代種子在逆境脅迫下的發(fā)芽率、發(fā)芽勢、活力指數(shù)、SOD、POD、CAT、APX酶活性及MDA、Pro、葉綠素含量進行了分析。研究結(jié)果表明:
1.ZmMYB59基因所表達的蛋白的亞細胞定位研究
從玉米自交系B73中克隆得到ZmMYB59基因,構(gòu)建了35S ZmMYB59-EYFP的融合表達載體,進行該基因的亞細胞定位分析。日本晴水稻原生質(zhì)體瞬時表達系統(tǒng)的研究結(jié)果表明:ZmMYB59蛋白定
3、位于細胞核。
2.ZmMYB59基因的啟動子缺失研究
克隆ZmMYB59基因起始密碼子前1000bp和2000bp,2個啟動子片段分別命名為MYB59-P、MYB9-P-2,構(gòu)建GUS植物表達載體pCXGUS-MYB-1K,pCXGUS-MYB-2K,并通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化日本晴水稻獲得GUS植物表達載體轉(zhuǎn)基因植株??山?jīng)過GUS染色法觀察外源基因的時空表達模式,預(yù)測ZmMYB59基因啟動子中重要的motif。分別對轉(zhuǎn)
4、pCXGUS-MYB-1K,pCXGUS-MYB-2K的T1代種子、萌發(fā)期和苗期的根、莖、葉進行GUS染色,GUS染色結(jié)果表明:pCXGUS-MYB-1K的種子沒有著色,pCXGUS-MYB-2K的種子胚乳邊緣著色;種子萌發(fā)期pCXGUS-MYB-1K只有芽尖著色,pCXGUS-MYB-2K芽尖和根均著色,芽尖著色較深,根維管束細胞少量著色;苗期pCXGUS-MYB-1K,pCXGUS-MYB-2K植株的根、莖、葉均能著色。推測ZmMY
5、B59基因的啟動子可能是組成型啟動子,同時也說明MYB59-P是啟動子發(fā)揮正常調(diào)控功能所必須的;而后者的根、莖、葉染色均比前者深,說明MYB59-P啟動能力不強,推測MYB59-P-2中可能存在增強啟動子表達的順式作用元件。
3.ZmMYB59基因在T2代轉(zhuǎn)基因煙草中的功能分析
對ZmMYB59基因過表達T2代煙草種子1cm播深(沙子)下的發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)及根長、苗高、葉寬;1.5%NaCl、8%P
6、EG和1cm播深下的SOD、POD、CAT、APX酶活性和MDA、Pro、葉綠素含量進行分析,結(jié)果表明:在1cm播深發(fā)芽實驗中轉(zhuǎn)基因煙草與野生型煙草相比發(fā)芽勢、發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)、鮮重都顯著降低,其中發(fā)芽率、活力指數(shù)、鮮重達到極顯著差異;1cm播深30d后轉(zhuǎn)基因煙草與野生型煙草相比根長、苗高、葉寬顯著降低,苗高和葉寬達到極顯著差異。1.5%NaCl處理48h后的過表達煙草與野生型煙草相比,SOD、POD、CAT和APX酶活性顯著
7、降低,Pro含量極顯著降低,MDA含量顯著升高;8%PEG處理48h后的過表達煙草與野生型相比,CAT、POD酶活性極顯著降低,SOD酶活性顯著降低,APX酶活性、Pro含量降低但不顯著,葉綠素含量極顯著升高;1cm播深處理48h后過表達煙草與野生型相比,CAT、POD、APX酶活性顯著降低,SOD酶活性極顯著降低,Pro含量極顯著降低,MDA含量升高但不顯著。脅迫處理后,過量表達ZmMYB59基因顯著降低了煙草ROS清除酶活性,而MD
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