牛成肌細(xì)胞高效表達(dá)啟動(dòng)子的篩選鑒定.pdf

1、牛肉具有蛋白質(zhì)高、脂肪低、膽固醇低等營養(yǎng)優(yōu)勢(shì),并且富含人類所需要的所有必需氨基酸和部分主要微量元素,正逐漸成為人類的主要肉類消費(fèi)品。隨著人們對(duì)牛肉性狀、質(zhì)量和營養(yǎng)上要求的提高,通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)繁育培養(yǎng)出具有優(yōu)良性狀的肉牛成為當(dāng)今研究的熱點(diǎn)?？紤]到轉(zhuǎn)基因的安全性,組織特異性啟動(dòng)子作為解決安全性問題的有力工具受到人們的重視。因此,在轉(zhuǎn)基因肉牛的研究中,肌肉高效特異性啟動(dòng)子的研究具有重要意義。本研究旨在通過基因重組技術(shù)構(gòu)建真核表達(dá)載體,利用轉(zhuǎn)錄

2、因子結(jié)合位點(diǎn)分析和序列對(duì)比合成啟動(dòng)子和選擇增強(qiáng)子,以期獲得牛肌肉高效特異性啟動(dòng)子。
　　 應(yīng)用PCR方法擴(kuò)增牛骨骼肌alpha-actin、MyIpf和Ckm基因5'調(diào)控區(qū)片段,在質(zhì)粒pGL3-Basic的多克隆位點(diǎn)插入基因片段構(gòu)建真核表達(dá)載體,脂質(zhì)體技術(shù)轉(zhuǎn)染魯西黃牛成肌細(xì)胞和成纖維細(xì)胞,利用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)比較alpha-actin、MyIpf,Ckm啟動(dòng)子的活性。以牛骨骼肌alpha-actin啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)前

3、82bp和148bp片段為核心啟動(dòng)子,用合成的調(diào)控序列和核心啟動(dòng)子分別構(gòu)成兩個(gè)合成啟動(dòng)子,將兩個(gè)核心啟動(dòng)子和兩個(gè)合成啟動(dòng)子分別插入pGL3-Basic載體中構(gòu)建成真核表達(dá)質(zhì)粒;根據(jù)鼠肌肉肌酸激酶Ckm增強(qiáng)子位置和序列,經(jīng)過序列比對(duì)和轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)分析,在牛肌肉肌酸激酶5'調(diào)控區(qū)內(nèi)找到有一段與鼠Ckm增強(qiáng)子相似的序列,為了驗(yàn)證該序列是否具有增強(qiáng)子的作用,將該序列分別連入合成啟動(dòng)子前構(gòu)建成真核表達(dá)質(zhì)粒。通過脂質(zhì)體技術(shù)轉(zhuǎn)染魯西黃牛成肌細(xì)胞和

4、成纖維細(xì)胞,利用雙螢光素酶報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)來檢測(cè)合成啟動(dòng)子和增強(qiáng)子的活性。
　　 轉(zhuǎn)染成肌細(xì)胞后,alpha-actin啟動(dòng)子活性較MyIpf和Ckm的活性高,轉(zhuǎn)染成纖維細(xì)胞后,三種啟動(dòng)子的活性與空載體pGL3-Basic的相當(dāng),初步證實(shí)了以上三種啟動(dòng)子的肌肉特異性。兩段核心啟動(dòng)子轉(zhuǎn)染成肌細(xì)胞后均有活性,可作為核心啟動(dòng)子進(jìn)行后期的合成啟動(dòng)子的構(gòu)建;合成啟動(dòng)子轉(zhuǎn)染成肌細(xì)胞后,合成的啟動(dòng)子調(diào)控元件可使82bp核心啟動(dòng)子活性提高大約1

5、40-400倍,使148bp核心啟動(dòng)子活性提高大約2-3倍,且以82bp為核心啟動(dòng)子構(gòu)建的合成啟動(dòng)子活性是alpha-actin啟動(dòng)子活性的4-6倍,但是以148bp為核心啟動(dòng)子構(gòu)建的合成啟動(dòng)子活性低于alpha-actin啟動(dòng)子的活性;增強(qiáng)子活性分析結(jié)果為,該序列可使合成啟動(dòng)子活性提高大約1-3倍,初步證明該序列具有增強(qiáng)子的作用,且連有增強(qiáng)子的82bp和148bp合成啟動(dòng)子其活性分別是alpha-aetin啟動(dòng)子活性的9-11倍和2-

6、3倍,其中連有增強(qiáng)子的82bp合成啟動(dòng)子活性約是CMV活性的1/6;將含有合成啟動(dòng)子和增強(qiáng)子的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染成纖維細(xì)胞,活性分析結(jié)果與其在成肌細(xì)胞中的相當(dāng),初步說明合成的啟動(dòng)子和增強(qiáng)子缺乏細(xì)胞特異性。
　　 本實(shí)驗(yàn)比較了天然存在的肌肉特異性啟動(dòng)子的活性,得到了一個(gè)活性較高的合成啟動(dòng)子,且在牛肌肉肌酸激酶5'調(diào)控區(qū)找到了一段具有增強(qiáng)子作用的序列。本實(shí)驗(yàn)得到的合成啟動(dòng)子和增強(qiáng)子為提高外源基因在牛肌肉中高效表達(dá)提供了實(shí)驗(yàn)材料,為牛肌肉高效特