牛Akirin1基因?qū)ε３杉〖?xì)胞分化的影響研究.pdf

1、脊椎動物的肌纖維在胚胎期形成,出生后數(shù)目不再改變。出生后肌肉的生長主要依賴衛(wèi)星細(xì)胞的增殖分化而導(dǎo)致肌纖維長度增加和周徑增大即肥大,而不是依賴肌細(xì)胞數(shù)目的增多即增生。研究肌肉發(fā)生的機(jī)制對于了解胚胎發(fā)育、細(xì)胞增殖與分化具有重要意義。脊椎動物生肌過程除由經(jīng)典的生肌決定因子家族(MRFs)、心肌細(xì)胞增強子2家族(MEF2s)以及肌肉生成抑制素(MSTN)調(diào)控外還依賴于其他眾多調(diào)節(jié)因子。這里我們研究了轉(zhuǎn)錄因子akirin1基因?qū)ε３杉〖?xì)胞分化的影

2、響,以期為產(chǎn)肉動物肉質(zhì)和產(chǎn)量的提高及肌營養(yǎng)不良和肌肉重生的治療等臨床應(yīng)用提供理論依據(jù),并為后續(xù)的轉(zhuǎn)基因牛提供理論基礎(chǔ)。
　　 本實驗應(yīng)用RT-PCR的方法擴(kuò)增了牛akifin1基因594bp的CDS區(qū)域,構(gòu)建了akirin1基因真核表達(dá)載體pIRES2-EGFP-akirin1,使用PEI轉(zhuǎn)染技術(shù)使akirin1基因在牛成肌細(xì)胞中瞬時高效表達(dá)。利用。Real-timePCR技術(shù)檢測了akirinl轉(zhuǎn)染細(xì)胞前后akirinl基因和

3、肌肉分化標(biāo)志性基因myogenin、MCK的mRNA表達(dá)水平變化,westernblot技術(shù)檢測了MRFs家族成員myogenin的蛋白水平在轉(zhuǎn)染akirin1基因前后的變化。應(yīng)用軟件和在線網(wǎng)站對akirin1基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析,初步預(yù)測了akifin1蛋白的保守結(jié)構(gòu)域和功能域,并預(yù)測了myogenin基因啟動子上游的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點。最后還使用雙熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)研究了akirin1基因?qū)yogenin基因啟動子活性的影響

4、。
　　 使用重組質(zhì)粒pIRES2-EGFP-akirin1轉(zhuǎn)染成肌細(xì)胞后的24h、48h、72h均能觀察到綠色熒光表明akirinl基因在成肌細(xì)胞中得到表達(dá)。通過Real-timePCR檢測到akirin1表達(dá)載體轉(zhuǎn)染成肌細(xì)胞后的24h、48h、72h時間點akirin1基因均有高水平表達(dá),肌肉分化相關(guān)的基因myogenin和MCK的mRNA水平也有不同程度的升高。Westernblot檢測到轉(zhuǎn)染akirin124h、48h、