牛血漿纖維粘連蛋白對(duì)大鼠成骨細(xì)胞增殖分化及凋亡的影響.pdf

1、中國(guó)醫(yī)科大學(xué)博士學(xué)位論文牛血漿纖維粘連蛋白對(duì)大鼠成骨細(xì)胞增殖分化及凋亡的影響姓名：薛明申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：博士專業(yè)：口腔臨床醫(yī)學(xué)指導(dǎo)教師：艾紅軍20040301本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用外源性FIN作用于體外培養(yǎng)的成骨細(xì)胞，旨在研究FN對(duì)成骨細(xì)胞增殖分化及凋亡的影響，探討應(yīng)用FN治療骨缺損性疾病的可行性。實(shí)驗(yàn)方法1成骨細(xì)胞的分離純化取生后2d的Wistar乳鼠拉頸處死后投入盛有75％乙醇的容器中消毒，剪開頭頂部皮膚，取顱蓋骨放入盛有緩沖液的培養(yǎng)皿中，用緩沖液

2、洗凈，加入025％胰蛋白酶溶液，在37％恒溫消化15min。再用lm∥nllⅡ型膠原酶溶液在37℃條件下消化90min，移于離心管中離心(1000r／min，5min)用199培養(yǎng)液將沉淀物洗兩次，吹散細(xì)胞沉淀，制成細(xì)胞懸液，接種于培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)。差速黏附法純化細(xì)胞。2成骨細(xì)胞的培養(yǎng)及鑒定調(diào)整上述已純化的細(xì)胞懸液細(xì)胞密度至106h／n11，接種于25ml培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，置于37℃、5％CO：培養(yǎng)箱中，2d后換液，除去未貼壁細(xì)胞，并適時(shí)傳代，另在一小

3、培養(yǎng)皿中加入蓋玻片，接種少量細(xì)胞懸液，置于37℃、5％CO：培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，用I型膠原免疫組化方法作細(xì)胞鑒定。3成骨細(xì)胞的形態(tài)學(xué)觀察應(yīng)用倒置相差顯微鏡動(dòng)態(tài)觀察成骨細(xì)胞的生長(zhǎng)特性并拍照記錄。將培養(yǎng)的成骨細(xì)胞用胰酶消化，離心，PBS沖洗，03％的戊二醛和四氧化鋨雙重固定，乙醇逐級(jí)脫水，醋酸異戊酯置換，臨界點(diǎn)干燥，噴金鍍膜，S一520型掃描電鏡觀察；培養(yǎng)形成單層細(xì)胞，經(jīng)膠原酶消化，分散離心獲得成骨細(xì)胞團(tuán)塊，加入4％戊二醛預(yù)固定，鋨酸染色，His

4、tachi一600型透射電鏡下觀察并拍照紀(jì)錄。4AlamarBluelM法測(cè)定細(xì)胞增殖率取培養(yǎng)的成骨細(xì)胞第3代，調(diào)整細(xì)胞濃度至2x104／ml，以每孔100出接種于96孔板，每組8孔，培養(yǎng)條件為37。C，5％CO：飽和濕度。在含10％胎牛血清的199液中培養(yǎng)48h，換成濃度為10pg／IIll，20彬IIll，30彬111l，401Lg／ml，50彬111l的牛血漿FN，無血清培養(yǎng)72h，在最后4h每孔加入20山的AlamarBlueT