STC-1對奶牛成骨細(xì)胞增殖分化的影響及MNP的成骨細(xì)胞毒性研究.pdf

1、斯鈣素1(Stanniocalcin-1，STC-1)是一種糖蛋白激素，最早在硬骨魚體內(nèi)發(fā)現(xiàn)，由魚類特有腺體－－位于腎臟的斯坦氏小體(Corpuscleof Stannius)的Ⅰ型分泌細(xì)胞分泌，STC-1對海水和淡水魚體內(nèi)鈣和磷酸鹽穩(wěn)態(tài)起重要的調(diào)節(jié)作用。哺乳動物的STC-1蛋白首先在人體內(nèi)發(fā)現(xiàn)。隨后在人和小鼠上克隆出了STC-1的cDNA，并在大鼠、犬、羊體內(nèi)發(fā)現(xiàn)該蛋白的存在。哺乳動物的STC-1以腸道和腎臟為主要靶器官，通過抑制腸道

2、對鈣吸收和促進(jìn)腎臟對磷的重吸收來調(diào)節(jié)體內(nèi)鈣、磷穩(wěn)態(tài)。探索研究STC-1在奶牛鈣磷穩(wěn)態(tài)調(diào)控中的作用及機制，有助于從細(xì)胞水平及分子水平上解析奶牛鈣、磷穩(wěn)態(tài)新的作用機制，為奶牛鈣磷代謝紊亂疾病防治提供新的靶點。
　　 1.斯鈣素-1在新生奶牛成骨細(xì)胞的定位和表達(dá)
　　 采用骨膜貼附法培養(yǎng)奶牛成骨細(xì)胞，通過堿性磷酸酶(ALP)染色，骨鈣素(Osteocalcin，OCN)免疫組化和體外成骨誘導(dǎo)試驗，對所培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行了鑒定。在成骨

3、細(xì)胞培養(yǎng)的10d，提取總RNA，設(shè)計STC-1特異性引物進(jìn)行RT-PCR擴增出奶牛STC-1特異性片段。同時采用免疫組化技術(shù)檢測到STC-1表達(dá)于體外培養(yǎng)10d奶牛成骨細(xì)胞。結(jié)果顯示通過骨膜貼附法可以得到奶牛成骨細(xì)胞。采用免疫組化和RT-PCR檢測到STC-1在奶牛成骨細(xì)胞的表達(dá)。
　　 2.STC-1對奶牛成骨細(xì)胞增殖和分化的影響
　　 采用不同濃度的rhSTC-1(0ng/ml、0.1ng/ml、1.0ng/ml、1

4、0.0ng/ml和100.0ng/ml)處理奶牛成骨細(xì)胞，MTT法檢測細(xì)胞增殖，檢測成骨細(xì)胞標(biāo)志分子ALP和OCN的表達(dá)變化，同時檢測體外礦化能力。STC-1可以抑制體外奶牛成骨細(xì)胞的增殖，對于ALP和OCN的表達(dá)影響具有濃度和時間上差異性，0.1-10.0ng/ml的STC-1可以促進(jìn)體外成骨細(xì)胞的礦化，100.0ng/ml對于體外礦化沒有影響。說明STC-1在調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞增殖和分化過程中的復(fù)雜性。
　　 3.CoCl2誘導(dǎo)奶

5、牛成骨細(xì)胞缺氧凋亡及對STC-1基因表達(dá)的影響
　　 本實驗探索CoCl2處理奶牛成骨細(xì)胞誘導(dǎo)缺氧，在不同時間點(0h，12h，24h，36h，48h)檢測細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)變化和STC-1等基因的表達(dá)變化。結(jié)果：CoCl2可以誘導(dǎo)奶牛成成骨細(xì)胞發(fā)生凋亡，在4個時間點均有明顯上升，在24h的表達(dá)量最高(P<0.01)。Bax mRNA的表達(dá)量在24h最高(P<0.05)。VDR mRNA在4個時間點表達(dá)均上升，在36h最高(P<0

6、.01)。結(jié)果表明CoCl2誘導(dǎo)奶牛成骨細(xì)胞缺氧中，STC-1基因參與了凋亡過程，Bax促進(jìn)凋亡的發(fā)生，VDR也參與這個凋亡過程。
　　 4.磁性納米鐵對奶牛成骨細(xì)胞的細(xì)胞毒性研究
　　 采用水相合成法合成MNP，通過TEM、Zeta電勢檢測儀來檢測合成MNP的理化特性。通過MTT法、Prussian Blue Staining、細(xì)胞骨架熒光染色和生化試劑盒來檢測不同濃度MNP(濃度分組：0μg/ml，50μg/ml，1