成骨細(xì)胞特異性識(shí)別多肽對(duì)人成骨細(xì)胞增殖和礦化影響的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、研究：以人顱骨成骨細(xì)胞為靶細(xì)胞，人牙齦成纖維細(xì)胞為吸附細(xì)胞對(duì)噬菌體十二肽庫(kù)進(jìn)行全細(xì)胞差減篩選，獲得與人成骨細(xì)胞特異性結(jié)合多肽，其氨基酸序列為：VLAVPWSEPGYL。本研究的目的旨在探討人成骨細(xì)胞特異性識(shí)別多肽對(duì)人成骨細(xì)胞增殖和礦化功能的影響，摸索并確定成骨細(xì)胞特異性識(shí)別多肽體外促進(jìn)人成骨細(xì)胞增殖礦化的最佳有效濃度，為該特異性多肽的進(jìn)一步研究及應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。具體研究?jī)?nèi)容和結(jié)果如下：
　　第一部分：MTT法檢測(cè)人成骨細(xì)胞的增殖

2、
　　體外常規(guī)培養(yǎng)人顱骨成骨細(xì)胞，用α-MEM培養(yǎng)基將成骨細(xì)胞特異性識(shí)別多肽配制成五種不同的濃度，分為5個(gè)實(shí)驗(yàn)組（10-4、10-5、10-6、10-7、10-8mol/L）以及空白對(duì)照組，分別于4，7 d進(jìn)行MTT檢測(cè)，獲得的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
　　結(jié)果表明:在此濃度范圍的成骨細(xì)胞特異性識(shí)別多肽能促進(jìn)人顱骨成骨細(xì)胞的增殖（P<0.05），其最佳有效作用濃度是10-5mol/L。
　　第二部分：堿性磷酸酶（alk

3、aline phosphatase, ALP）活性檢測(cè)
　　體外常規(guī)培養(yǎng)人顱骨成骨細(xì)胞，用α-MEM培養(yǎng)基將成骨細(xì)胞特異性識(shí)別多肽配制成五種不同的濃度，分為5個(gè)實(shí)驗(yàn)組（10-4、10-5、10-6、10-7、10-8mol/L）以及空白對(duì)照組，分別于第4、7 d取出細(xì)胞，按照ALP檢測(cè)試劑盒以及BCA蛋白法步驟進(jìn)行檢測(cè)。將ALP活性除以測(cè)得的細(xì)胞總蛋白即可得到單位蛋白含量的相對(duì)ALP活性，獲得的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
　　

4、結(jié)果表明：在此濃度范圍的成骨細(xì)胞特異性識(shí)別多肽能促進(jìn)人顱骨成骨細(xì)胞ALP活性的表達(dá)（P<0.05），其最佳有效作用濃度是10-4mol/L。
　　第三部分：茜素紅染色及半定量分析檢測(cè)人成骨細(xì)胞鈣化程度
　　體外常規(guī)培養(yǎng)人顱骨成骨細(xì)胞，用α-MEM培養(yǎng)基將成骨細(xì)胞特異性識(shí)別多肽配制成五種不同的濃度，分為5個(gè)實(shí)驗(yàn)組（10-4、10-5、10-6、10-7、10-8mol/L）以及空白對(duì)照組，分別于第14、21 d取出細(xì)胞，漂洗，

5、固定，茜素紅染色，掃描儀掃描照片。每孔加入氯化十六烷基吡啶，待茜素紅溶解后，測(cè)得吸光度值，獲得的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
　　結(jié)果表明：在此濃度范圍的成骨細(xì)胞特異性識(shí)別多肽能促進(jìn)成骨細(xì)胞的鈣鹽沉積，半定量分析結(jié)果顯示在濃度10-5mol/L時(shí)，吸光度（OD）值最高，但實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　第四部分：RT-QPCR檢測(cè)人成骨細(xì)胞骨鈣素（OCN）mRNA的表達(dá)
　　體外常規(guī)培養(yǎng)人顱骨成骨細(xì)胞，用α-ME

6、M培養(yǎng)基將成骨細(xì)胞特異性識(shí)別多肽配制成五種不同的濃度，分為5個(gè)實(shí)驗(yàn)組（10-4、10-5、10-6、10-7、10-8mol/L）以及空白對(duì)照組，分別于于第14、21 d取出細(xì)胞，提取RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，使用RT-QPCR檢測(cè)試劑盒檢測(cè)，獲得的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
　　結(jié)果表明：在此濃度范圍的成骨細(xì)胞特異性識(shí)別多肽能促進(jìn)成骨細(xì)胞OCNmRNA的表達(dá)（P<0.05），其最佳有效作用濃度10-6mol/L。
　　總結(jié)：成骨細(xì)胞