小鼠成骨細(xì)胞特異性長鏈非編碼RNA影響其功能的研究.pdf

1、第一部分小鼠長鏈非編碼RNA模式及成骨細(xì)胞特異性長鏈非編碼RNA篩選
　　目的：
　　研究lncRNA在小鼠體內(nèi)多個(gè)組織器官或細(xì)胞中的表達(dá)模式，尋找新的成骨細(xì)胞特異性表達(dá)或優(yōu)先表達(dá)的lncRNA。
　　方法：
　　首先購買C57BL/66周齡、雄性小鼠，無菌條件下取其心、肝、肺、腎、腦組織，在液氮中浸沒并使其迅速降溫保存。培養(yǎng)小鼠成骨細(xì)胞。隨之提取組織、細(xì)胞total RNA并予以純化，合成cDNA并予以PCR擴(kuò)

2、增，繼之合成熒光標(biāo)記cRNA并行PCR擴(kuò)增，純化熒光標(biāo)記cRNA并測(cè)量其濃度。將cRNA片段化并和芯片雜交。獲得microarray數(shù)據(jù)后將數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，多組數(shù)據(jù)比對(duì)分析，研究小鼠心、肝、肺、腎、腦中l(wèi)ncRNA的表達(dá)及分布，重點(diǎn)研究小鼠成骨細(xì)胞特異性表達(dá)或優(yōu)先表達(dá)的lncRNA。用Northern blot驗(yàn)證所挑選的lncRNA在不同組織和細(xì)胞的表達(dá)水平。
　　結(jié)果：
　　(1) lncRNA在小鼠心、肝、肺、腎、腦及

3、成骨細(xì)胞中表現(xiàn)出不同的表達(dá)模式。(2)發(fā)現(xiàn)有17個(gè)lncRNA在成骨細(xì)胞表達(dá)而在其他組織中不表達(dá)或極低表達(dá)。(3)發(fā)現(xiàn)一種lncRNA，暫命名為lncRNA-OB。該lncRNA在成骨細(xì)胞高表達(dá)，而在其他組織中幾乎不表達(dá)或極低表達(dá)。lncRNA-OB位于小鼠第4條染色體。lncRNA-OB在小鼠成骨細(xì)胞高表達(dá)，在心、肝、肺、腎、腦組織表達(dá)較低或不表達(dá)。
　　結(jié)論：
　　發(fā)現(xiàn)一個(gè)新的成骨細(xì)胞特異性表達(dá)的lncRNA，小鼠體內(nèi)l

4、ncRNA表達(dá)分布或與其功能有關(guān)。
　　第二部分小鼠成骨細(xì)胞特異性長鏈非編碼RNA對(duì)其功能的影響
　　目的：
　　研究小鼠成骨細(xì)胞特異性長鏈非編碼RNA對(duì)其功能的作用。
　　方法：
　　針對(duì)第一部分實(shí)驗(yàn)篩選出來的lncRNA——lncRNA-OB，通過siRNA抑制其在ST2細(xì)胞中的表達(dá)，觀察抑制其表達(dá)前后ST2細(xì)胞誘導(dǎo)成骨分化過程中的堿性磷酸酶表達(dá)及骨鈣素分泌情況，以及RUNX2與Osterix的表達(dá)情況

5、。在Genbank查找lncRNA-OB的上游基因、下游基因并分析其功能。
　　結(jié)果：
　　(1)用siRNA使lncRNA-OB低表達(dá)，ST2細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化過程中骨鈣素分泌和堿性磷酸酶活性明顯減少。(2)用siRNA使lncRNA-OB低表達(dá)，ST2細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化過程中RUNX2 mRNA和Osterix mRNA的表達(dá)明顯降低。(3) lncRNA-OB上游基因和下游基因的查找。
　　結(jié)論：
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