對(duì)長(zhǎng)鏈非編碼RNA序列、進(jìn)化與種系特異性的計(jì)算研究.pdf

1、目的:
　　長(zhǎng)鏈非編碼RNA研究目前面臨幾個(gè)重要的適合于計(jì)算分析的問(wèn)題:(1)具有重要功能的IncRNA起源于哺乳動(dòng)物進(jìn)化的什么時(shí)期。(2)長(zhǎng)鏈非編碼RNA如何獲得多個(gè)外顯子以及功能域。(3)如何預(yù)測(cè)長(zhǎng)鏈非編碼RNA的DNA結(jié)合域和結(jié)合位點(diǎn)，從而預(yù)測(cè)長(zhǎng)鏈非編碼RNA的靶基因。(4)長(zhǎng)鏈非編碼RNA的DNA結(jié)合域是否有一個(gè)逐漸進(jìn)化的過(guò)程。(5)長(zhǎng)鏈非編碼RNA呈現(xiàn)怎樣的種系特異性，尤其是，人類(lèi)與靈長(zhǎng)類(lèi)有哪些特異性的長(zhǎng)鏈非編碼RNA。

2、針對(duì)這些問(wèn)題，本研究的主要目的是:(1)揭示若干重要長(zhǎng)鏈非編碼RNA的起源;(2)揭示這些長(zhǎng)鏈非編碼RNA的進(jìn)化特點(diǎn)，包括轉(zhuǎn)座子對(duì)長(zhǎng)鏈非編碼RNA的進(jìn)化影響:(3)揭示長(zhǎng)鏈非編碼RNA的種系特異性，尤其是靈長(zhǎng)類(lèi)或人類(lèi)特異的長(zhǎng)鏈非編碼RNA;(4)揭示長(zhǎng)鏈非編碼RNA功能域起源與進(jìn)化的特性;(5)設(shè)計(jì)開(kāi)發(fā)預(yù)測(cè)長(zhǎng)鏈非編碼RNA:DNA的結(jié)合域與結(jié)合位點(diǎn)的算法與軟件，分析典型長(zhǎng)鏈非編碼RNA的DNA結(jié)合域與結(jié)合位點(diǎn)。
　　方法：

3、　　針對(duì)上述研究目的，本研究采用并發(fā)展了如下研究方法。
　　1.識(shí)別人類(lèi)長(zhǎng)鏈非編碼RNA在其它物種的直系同源物
　　根據(jù)基因組搜索來(lái)確定GENCODE項(xiàng)目報(bào)道的13562個(gè)人類(lèi)長(zhǎng)鏈非編碼RNA和其它實(shí)驗(yàn)研究報(bào)道的重要長(zhǎng)鏈非編碼RNA在其它物種的同源序列。鑒于補(bǔ)償性突變使得長(zhǎng)鏈非編碼RNA的同源序列具有序列保守性低而結(jié)構(gòu)保守性高的特性，BLAST/BLAT不能可靠地搜索長(zhǎng)鏈非編碼RNA的同源序列，我們用基于結(jié)構(gòu)比對(duì)的RNA搜索

4、軟件Infernal來(lái)搜索長(zhǎng)鏈非編碼RNA在多個(gè)物種的同源序列。大規(guī)模的基因組搜索在本地服務(wù)器和廣州超級(jí)計(jì)算中心的天河二號(hào)計(jì)算機(jī)進(jìn)行。
　　2.分析長(zhǎng)鏈非編碼RNA的序列特征與進(jìn)化特征
　　用Phylip、MrBayes、 MEGA等構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)，用PAML軟件分析進(jìn)化速度，用EvoNC分析長(zhǎng)鏈非編碼RNA相對(duì)于參照基因所受的選擇壓力，用Phylip及MEGA和不同模型計(jì)算序列間距離（選用12S和16S rRNA作為中性參考序

5、列），用Pmmulti和RNAalifold進(jìn)行外顯子結(jié)構(gòu)比對(duì)，用RNAfold和Mfold預(yù)測(cè)外顯子的保守結(jié)構(gòu)。
　　3.根據(jù)人類(lèi)長(zhǎng)鏈非編碼RNA的同源基因揭示人類(lèi)與靈長(zhǎng)類(lèi)特異性長(zhǎng)鏈非編碼RNA
　　我們將13562個(gè)人類(lèi)長(zhǎng)鏈非編碼RNA在16個(gè)哺乳類(lèi)動(dòng)物的直系同源狀態(tài)轉(zhuǎn)為離散數(shù)據(jù)，1表示該基因在某物種中存在直系同源基因，0表示該基因在某物種中不存在直系同源基因，然后基于這些離散狀態(tài)估計(jì)長(zhǎng)鏈非編碼RNA在系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)下的ga

6、in/loss事件。
　　4.設(shè)計(jì)開(kāi)發(fā)預(yù)測(cè)長(zhǎng)鏈非編碼RNA的DNA結(jié)合域與結(jié)合位點(diǎn)的軟件LongTarget
　　LongTarget軟件主要立足于三點(diǎn):全面的Hoogsteen和反Hoogsteen堿基配對(duì)規(guī)則、局部比對(duì)、以及對(duì)所有TFO/TTS預(yù)測(cè)的分析。我們通過(guò)系統(tǒng)回顧相關(guān)文獻(xiàn)整理出24條Hoogsteen和反Hoogsteen堿基配對(duì)規(guī)則集，對(duì)于一段感興趣的雙鏈DNA區(qū)域，根據(jù)每一條堿基配對(duì)規(guī)則集重構(gòu)四條RNA序列，

7、根據(jù)局部比對(duì)同時(shí)識(shí)別一個(gè)長(zhǎng)鏈非編碼RNA的DNA結(jié)合域和這段DNA區(qū)域中的長(zhǎng)鏈非編碼RNA結(jié)合位點(diǎn)。我們用置換檢驗(yàn)來(lái)評(píng)估預(yù)測(cè)結(jié)果的敏感性與專一性。
　　5.考察長(zhǎng)鏈非編碼RNA功能域的進(jìn)化特性
　　使用LongTarget，我們不僅預(yù)測(cè)人類(lèi)HOTAIR的DNA結(jié)合域，還預(yù)測(cè)其它物種HOTMR的DNA結(jié)合域，從而揭示HOTMR DNA結(jié)合域的種系差異和進(jìn)化特性。
　　結(jié)果：
　　1.HOTMR的分析結(jié)果
　　

8、HOTAIR的直系同源基因僅存在于真哺乳動(dòng)物中，且外顯子表現(xiàn)出種系特異性缺失，HOTMR exon2在dog、mouse和rat中沒(méi)有找到直系同源序列，而且HOTAIR的功能域與保守區(qū)也表現(xiàn)出種系特異性缺失，長(zhǎng)達(dá)1800bp的人類(lèi)HOTMR exon6在靈長(zhǎng)類(lèi)中有得分較高的較完整的匹配，但在其它哺乳動(dòng)物匹配的得分很低，尤其是在mouse和rat中僅有很短的匹配，一大段的保守區(qū)在mouse和rat HOTAIR缺失。
　　2.ANR

9、IL的分析結(jié)果
　　與HOTAIR類(lèi)似，沒(méi)有在非哺乳脊椎動(dòng)物、單孔目哺乳動(dòng)物和有袋類(lèi)哺乳動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)ANRIL的直系同源物。ANRIL的直系同源序列最早出現(xiàn)于貧齒目(sloth)和非洲獸總目(elephant)中，其基因結(jié)構(gòu)逐漸在勞亞獸總目中豐富起來(lái)。但是，一方面，在免形目和嚙齒目的分枝中ANRIL的外顯子逐漸丟失，進(jìn)而在mouse和rat中完全丟失，另一方面，在類(lèi)人猿中ANRIL獲得完整的基因結(jié)構(gòu)和19個(gè)外顯子。
　　ANR

10、IL外顯子在早期靈長(zhǎng)類(lèi)(tree shrew，tarsier)呈現(xiàn)出特殊和活躍的進(jìn)化。多個(gè)轉(zhuǎn)座子主要在類(lèi)人猿插入ANRIL，轉(zhuǎn)座子插入增進(jìn)了ANRIL外顯子序列與二級(jí)結(jié)構(gòu)的保守性。
　　3.人類(lèi)長(zhǎng)鏈非編碼RNA的種系特異性分析結(jié)果
　　由GENCODE項(xiàng)目第一期確定的13562個(gè)人類(lèi)長(zhǎng)鏈非編碼RNA在其它物種的直系同源基因數(shù)目統(tǒng)計(jì)如下:單孔目哺乳動(dòng)物platypus有1008個(gè)(7％)，chimpanzee有13239個(gè)(9

11、8％)，嚙齒目動(dòng)物中的mouse和rat分別為4416個(gè)(30％)和4099個(gè)(28％)。
　　用mix軟件估計(jì)了長(zhǎng)鏈非編碼RNA在各個(gè)祖先節(jié)點(diǎn)的gain/loss數(shù)量，嚙齒目、兔類(lèi)、樹(shù)鼩目和靈長(zhǎng)目的早期共同祖先有7458個(gè)(55％)同源基因，在此之后，同源基因的數(shù)量在嚙齒目和兔類(lèi)祖先有逐漸降低的趨勢(shì)，而在靈長(zhǎng)目和樹(shù)鼩目的祖先則迅速增多，在靈長(zhǎng)目祖先增加到10498個(gè)(77％)。
　　4.長(zhǎng)鏈非編碼RNA的DNA結(jié)合域與結(jié)合

12、位點(diǎn)預(yù)測(cè)算法
　　基于24條Hoogsteen和反Hoogsteen堿基配對(duì)規(guī)則集，開(kāi)發(fā)了預(yù)測(cè)長(zhǎng)鏈非編碼RNA的DNA結(jié)合域和結(jié)合位點(diǎn)的軟件LongTarget，該算法表現(xiàn)出高敏感性和專一性。
　　5.典型長(zhǎng)鏈非編碼RNA的DNA結(jié)合域與結(jié)合位點(diǎn)預(yù)測(cè)
　　用LongTarget分析了逾20個(gè)典型長(zhǎng)鏈非編碼RNA，并和Triplexator的預(yù)測(cè)結(jié)果進(jìn)行了比較，我們發(fā)現(xiàn)LongTarget預(yù)測(cè)出來(lái)的DNA結(jié)合位點(diǎn)位于目標(biāo)

13、基因的啟動(dòng)子區(qū)域、CpG島和轉(zhuǎn)座子區(qū)域，而且與ChIP-seq實(shí)驗(yàn)揭示的染色質(zhì)組蛋白甲基化區(qū)域高度吻合。相比而言，Triplexator的許多預(yù)測(cè)結(jié)果偏離了啟動(dòng)子區(qū)域等重要已知調(diào)控元件。
　　結(jié)論：
　　1.HOTAIR和ANRIL起源于真哺乳動(dòng)物，HOTAIR在進(jìn)化中獲得功能域，而ANRIL則在進(jìn)化中獲得外顯子，兩個(gè)基因都表現(xiàn)出種系特異性進(jìn)化特征，提示長(zhǎng)鏈非編碼RNA序列與功能的種系特異性，也提示長(zhǎng)鏈非編碼RNA與種系形成

14、可能有密切關(guān)系。
　　2.ANRIL以及其它許多長(zhǎng)鏈非編碼RNA的形成與進(jìn)化與轉(zhuǎn)座子有密切的聯(lián)系，轉(zhuǎn)座子的插入及馴化對(duì)ANRIL外顯子的序列、結(jié)構(gòu)、保守性有顯著的影響。長(zhǎng)鏈非編碼RNA與轉(zhuǎn)座子的關(guān)系也是長(zhǎng)鏈非編碼RNA種系特異性的一個(gè)重要方面。
　　3.根據(jù)對(duì)13562個(gè)人類(lèi)長(zhǎng)鏈非編碼RNA同源基因的分析，我們發(fā)現(xiàn)它們表現(xiàn)出明顯的種系特異性，且大量人類(lèi)長(zhǎng)鏈非編碼RNA是靈長(zhǎng)類(lèi)特有的，其中約2％是人類(lèi)特有的。特別是，在單孔目哺