長(zhǎng)鏈非編碼RNA NRAV對(duì)RSV細(xì)胞內(nèi)增殖的影響及機(jī)制研究.pdf

1、在哺乳動(dòng)物基因組中，存在著大量具有低蛋白表達(dá)能力的RNA長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄本—長(zhǎng)鏈非編碼RNA（long noncoding RNA，lncRNAs），它的長(zhǎng)度一般在200 nt以上，具有相對(duì)保守的二級(jí)結(jié)構(gòu)、一定的亞細(xì)胞定位和剪接形式，其種類、數(shù)量及作用機(jī)制尚不完全明確。lncRNAs在宿主與病毒博弈過程中廣泛存在，Yin等通過全轉(zhuǎn)錄本測(cè)序發(fā)現(xiàn)SARS冠狀病毒感染的小鼠體內(nèi)、IAV感染的人肺上皮細(xì)胞中和EV71感染的RD細(xì)胞中均存在差異表達(dá)的長(zhǎng)鏈非

2、編碼RNA。其中有些病毒可以通過與lncRNAs相互作用來調(diào)節(jié)宿主和/或病毒的基因表達(dá)，從而影響病毒自身的潛伏或復(fù)制；有些lncRNAs能夠協(xié)助病毒復(fù)制，幫助其逃離免疫監(jiān)視，抑制抗病毒免疫。由此可見 lncRNAs在病毒感染及抗病毒免疫中發(fā)揮著重要作用。然而，在病毒感染疾病中只有部分lncRNAs的功能得到了詳細(xì)研究。
　　呼吸道合胞病毒（RSV）是有包膜的單股負(fù)鏈RNA病毒，是引起嬰幼兒呼吸道病毒感染的重要病原體之一；在RSV引

3、起的上呼吸道感染中，25～40％會(huì)合并更為嚴(yán)重的下呼吸道感染，導(dǎo)致毛細(xì)支氣管炎或肺炎。那么在 RSV與宿主細(xì)胞博弈過程中是否有 lncRNAs的參與呢？我們?cè)贘ohnmattick構(gòu)建的lncRNAdb數(shù)據(jù)庫中檢索到了4條與RNA病毒或呼吸道病毒感染有關(guān)的lncRNAs，包括NEAT1，PRINS，NEST和NRAV。通過RSV感染驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)只有長(zhǎng)鏈非編碼RNA NRAV的表達(dá)量與假感染組有差異。有關(guān) NRAV表達(dá)與病毒感染之關(guān)系，

4、歐陽晶等曾發(fā)現(xiàn)在甲型流感病毒、仙臺(tái)病毒、呼腸孤病毒和單純皰疹病毒感染呼吸道上皮細(xì)胞時(shí)NRAV表達(dá)下調(diào)，并且NRAV能夠通過抑制細(xì)胞ISG基因轉(zhuǎn)錄促進(jìn)病毒復(fù)制。
　　長(zhǎng)鏈非編碼RNA功能廣泛，可以在DNA、RNA或蛋白質(zhì)水平上分別或同時(shí)發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。其調(diào)控機(jī)制之一—競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源RNA（competitive endogenous RNA, ceRNA）表明，細(xì)胞內(nèi)存在著一種以miRNA為樞紐的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，如果lncRNAs和蛋白質(zhì)

5、編碼基因的mRNA可以共享相同的miRNA反應(yīng)原件（MRE），lncRNAs就可以通過結(jié)合 miRNA，起到對(duì)miRNA控制的下游靶基因表達(dá)增強(qiáng)或減弱的間接調(diào)控作用，故也將具有ceRNA作用的lncRNAs稱為“分子海綿”?？紤]到lnc-NRAV在細(xì)胞中的定位主要是細(xì)胞漿，而胞漿也是成熟miRNA的分布區(qū)域，在本研究中，我們以呼吸道上皮細(xì)胞A549和BEAS-2B細(xì)胞作為RSV的感染模型，以胞漿 lnc-NRAV及其調(diào)控的下游 miRN

6、A、靶基因?yàn)檠芯繉?duì)象，深入探討了lnc-NRAV對(duì)RSV感染的影響，進(jìn)一步豐富了對(duì)lncRNAs與呼吸道感染病毒相互關(guān)系的了解。
　　第一部分：RSV感染對(duì)呼吸道上皮細(xì)胞 lnc-NRAV表達(dá)的影響及l(fā)nc-NRAV對(duì)病毒增殖的調(diào)節(jié)作用
　　目的：
　　通過qRT-PCR驗(yàn)證RSV感染細(xì)胞長(zhǎng)鏈非編碼RNA NEAT1、PRINS、NEST和NRAV的表達(dá)情況；利用生物信息學(xué)手段，了解長(zhǎng)鏈RNA NRAV的蛋白質(zhì)編碼能力

7、和序列保守性；通過qRT-PCR，探討RSV感染對(duì)A549和BEAS-2B細(xì)胞lnc-NRAV表達(dá)的影響；通過敲低或過表達(dá)細(xì)胞中l(wèi)nc-NRAV的表達(dá)量，探討lnc-NRAV對(duì)病毒增殖可能的影響。
　　方法：
　　1.RSV（MOI=3）感染A549細(xì)胞后12h、24h、36h，qRT-PCR檢測(cè)長(zhǎng)鏈非編碼RNA NEAT1、PRINS、NEST和NRAV的表達(dá)情況。
　　2.根據(jù)上一步的檢測(cè)結(jié)果，只有長(zhǎng)鏈RNA NR

8、AV在RSV感染的A549細(xì)胞中有表達(dá)變化。故使用 LNCipedia、UCSC數(shù)據(jù)庫分析長(zhǎng)鏈RNA NRAV的蛋白質(zhì)編碼能力、二級(jí)結(jié)構(gòu)和序列保守性。
　　3.以感染復(fù)數(shù)MOI=3的RSV病毒感染A549或BEAS-2B細(xì)胞28h，每2h收取一次細(xì)胞總RNA，qRT-PCR檢測(cè)lnc-NRAV表達(dá)量。
　　4.在過表達(dá) lnc-NRAV的細(xì)胞中感染 RSV，感染后第4～28h每4h收取一次細(xì)胞總RNA，qRT-PCR檢測(cè)RS

9、V NS1、N、F、G、M、M2基因的相對(duì)表達(dá)量；在感染后第24h、48h、72h收取細(xì)胞總蛋白，Western blot檢測(cè)RSVF蛋白的表達(dá)量；在感染后第24～48h每4h收取一次細(xì)胞上清，病毒空斑試驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞上清中RSV病毒滴度的變化情況。
　　5.在敲低lnc-NRAV的細(xì)胞中感染RSV,在感染后第4～28h每4h收取細(xì)胞總RNA，qRT-PCR檢測(cè)RSV相關(guān)基因的相對(duì)表達(dá)量；在感染后第24h、48h、72h收取細(xì)胞總蛋白

10、，Western blot檢測(cè)RSV F蛋白的表達(dá)量；在感染后第24h～48h每4h收取一次細(xì)胞上清，病毒空斑試驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞上清中RSV病毒滴度的變化情況。
　　結(jié)果：
　　1.lnc-NRAV在 RSV感染 A549（MOI=3）第24h、36h表達(dá)下降（P<0.05）；lncRNA NEAT1、PRINS、NEST的表達(dá)無明顯變化（P>0.05）。
　　2.lnc-NRAV不具備編碼蛋白質(zhì)的功能，具有由多個(gè)莖環(huán)結(jié)構(gòu)組

11、成的二級(jí)結(jié)構(gòu)，與小鼠等其他脊椎動(dòng)物同源性較低。
　　3.RSV感染A54920h后，lnc-NRAV的表達(dá)量逐漸下降（P<0.05）；RSV感染BEAS-2B8h后，lnc-NRAV的表達(dá)量逐漸下降（P<0.05）。
　　4.在細(xì)胞中，上調(diào)lnc-NRAV的表達(dá)能夠促進(jìn)RSV的復(fù)制。
　　在過表達(dá)lnc-NRAV的細(xì)胞中感染RSV，RSV相關(guān)基因的相對(duì)表達(dá)量明顯高于對(duì)照組（P<0.05），RSVF蛋白表達(dá)量明顯高于對(duì)照

12、組（P<0.05），細(xì)胞上清中RSV病毒滴度高于對(duì)照組（P<0.05）。
　　5.在細(xì)胞中，下調(diào)lnc-NRAV的含量能夠抑制RSV的復(fù)制。
　　在敲低lnc-NRAV的細(xì)胞中感染RSV，RSV相關(guān)基因的表達(dá)量明顯低于對(duì)照組（P<0.05）；RSVF蛋白表達(dá)量明顯低于對(duì)照組（P<0.05）；細(xì)胞上清中RSV病毒滴度低于對(duì)照組（P<0.05）。
　　第二部分：lnc-NRAV結(jié)合miR-125a/b-5p的預(yù)測(cè)及驗(yàn)證

13、r>　　目的：
　　利用生物信息學(xué)手段，預(yù)測(cè) lnc-NRAV是否具有結(jié)合 miRNA的潛力；通過雙熒光素酶報(bào)告試驗(yàn)、過表達(dá) lnc-NRAV或 lnc-NRAVmut及回復(fù)試驗(yàn)，驗(yàn)證在呼吸道上皮細(xì)胞中l(wèi)nc-NRAV通過不完全互補(bǔ)配對(duì)結(jié)合miRNA的可能性。
　　方法：
　　1.使用miRDB數(shù)據(jù)庫預(yù)測(cè)lnc-NRAV結(jié)合miRNA的潛力。
　　2.將野生型lnc-NRAV序列插入雙熒光素酶報(bào)告載體pmirGL

14、O的多克隆位點(diǎn)，構(gòu)建雙熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒pmirGLO-NRAV。將突變型lnc-NRAV序列插入pmirGLO的多克隆位點(diǎn)，構(gòu)建雙熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒pmirGLO-NRAVmut。在A549或BEAS-2B細(xì)胞中，將pmir-GLO、pmir-GLO-NRAV或pmir-GLO-NRAVmut與miR-125 mimics共轉(zhuǎn)染，通過雙熒光素酶報(bào)告試驗(yàn)檢測(cè)lnc-NRAV通過不完全互補(bǔ)配對(duì)結(jié)合miRNA的可能性。
　　3.在細(xì)胞中過

15、表達(dá)或敲低miR-125a/b-5p，檢測(cè)lnc-NRAV的表達(dá)量。
　　4.構(gòu)建突變型lnc-NRAV過表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1-NRAVmut。在A549或BEAS-2B細(xì)胞中過表達(dá)野生型或突變型lnc-NRAV，檢測(cè)細(xì)胞中游離miR-125a-5p與miR-125b-5p的含量。
　　5.在細(xì)胞中過表達(dá)lnc-NRAV、lnc-NRAVmut，或過表達(dá)lnc-NRAV的同時(shí)過表達(dá)miR-125a/b-5p，RSV感染后

16、48h收取細(xì)胞總RNA，經(jīng)qRT-PCR檢測(cè)RSV相關(guān)基因的相對(duì)表達(dá)量；收取細(xì)胞總蛋白，Western blot檢測(cè)RSV F蛋白的表達(dá)量；收取細(xì)胞上清，病毒空斑試驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞上清中RSV病毒滴度的變化情況。
　　6.在細(xì)胞中敲低lnc-NRAV，或敲低lnc-NRAV的同時(shí)敲低 miR-125a/b-5p，RSV感染后48h收取細(xì)胞總RNA，經(jīng)qRT-PCR檢測(cè)RSV相關(guān)基因的相對(duì)表達(dá)量；收取細(xì)胞總蛋白，Western blot檢

17、測(cè)RSV F蛋白的表達(dá)量；收取細(xì)胞上清，病毒空斑試驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞上清中RSV病毒滴度的變化情況。
　　結(jié)果：
　　1.在A549或BEAS-2B中，lnc-NRAV可以通過不完全互補(bǔ)配對(duì)結(jié)合miR-125a/b-5p。
　　2.在細(xì)胞中過表達(dá)或敲低miR-125a/b-5p，lnc-NRAV的表達(dá)量與對(duì)照組相比無明顯變化（P>0.05）。
　　3.過表達(dá)野生型lnc-NRAV，細(xì)胞中游離miR-125a-5p與miR

18、-125b-5p的含量下降（P<0.05），促進(jìn)病毒復(fù)制。過表達(dá)突變型lnc-NRAV，miR-125a-5p與miR-125b-5p含量與對(duì)照組相比無明顯變化（P>0.05），對(duì)病毒復(fù)制無影響。
　　4.過表達(dá)lnc-NRAV的同時(shí)過表達(dá)miR-125a/b-5p，或者在敲低lnc-NRAV的同時(shí)敲低miR-125a/b-5p，會(huì)使呼吸道上皮細(xì)胞中RSV產(chǎn)量回復(fù)到對(duì)照組水平。
　　第三部分：lnc-NRAV間接調(diào)控的ceR

19、NA環(huán)路靶mRNA的預(yù)測(cè)及驗(yàn)證
　　目的：
　　利用生物信息學(xué)手段，預(yù)測(cè)miR-125a/b-5p可能的靶基因，通過雙熒光素酶報(bào)告試驗(yàn)驗(yàn)證預(yù)測(cè)結(jié)果；在 RSV感染的呼吸道上皮細(xì)胞A549或BEAS-2B中，驗(yàn)證lnc-NRAV與miR-125參與的ceRNA環(huán)路中的可能靶mRNA。
　　方法：
　　1.利用Targetscan、miRDB和microRNA三個(gè)生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫共同預(yù)測(cè)miR-125a-5p、miR

20、-125b-5p的靶基因，根據(jù)預(yù)測(cè)結(jié)果的交集選擇可能的靶 mRNA。根據(jù)預(yù)測(cè)結(jié)果，miR-125a/b-5p可能的靶基因有 IL-6R、IRF4、IL-31、CD5L、IL-16、CXCL13。通過qRT-PCR檢測(cè)了A549和BEAS-2B細(xì)胞中以上預(yù)測(cè)基因的表達(dá)量，因結(jié)果提示，只有IL6-R在A549和BEAS-2B細(xì)胞中有表達(dá)，故后續(xù)試驗(yàn)圍繞IL-6R設(shè)計(jì)進(jìn)行。
　　2.構(gòu)建雙熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒pmirGLO-IL-6R。在細(xì)

21、胞中轉(zhuǎn)染pmirGLO-IL-6R的同時(shí)分別共轉(zhuǎn)染 pcDNA3.1、pcDNA3.1-NRAV或pcDNA3.1-NRAVmut，在回復(fù)試驗(yàn)中共轉(zhuǎn)染 pmirGLO-IL-6R與pcDNA3.1-NRAV的同時(shí)轉(zhuǎn)染miR-125a mimics或miR-125b mimics，檢測(cè)各組熒光素酶的表達(dá)量。
　　3.在細(xì)胞中轉(zhuǎn)染pmirGLO-IL-6R的同時(shí)敲低lnc-NRAV，在回復(fù)試驗(yàn)中共轉(zhuǎn)染pmirGLO-IL-6R與si-

22、NRAV的同時(shí)轉(zhuǎn)染miR-125a inhibitor或miR-125b inhibitor，檢測(cè)各組熒光素酶的表達(dá)量。
　　4.過表達(dá)lnc-NRAV、lnc-NRAVmut，或過表達(dá)lnc-NRAV的同時(shí)過表達(dá)miR-125a/b-5p，收取細(xì)胞總RNA，通過qRT-PCR檢測(cè)各組IL-6R相對(duì)表達(dá)量；收取細(xì)胞總蛋白，Western blot測(cè)各組IL-6R的表達(dá)量。
　　5.敲低lnc-NRAV或敲低lnc-NRAV的

23、同時(shí)敲低miR-125a/b-5p，收取細(xì)胞總RNA，通過qRT-PCR檢測(cè)各組IL-6R相對(duì)表達(dá)量；收取細(xì)胞總蛋白，Western blot測(cè)各組IL-6R的表達(dá)量。
　　6.過表達(dá)miR-125a/b-5p或過表達(dá) miR-125a/b-5p的同時(shí)過表達(dá)lnc-NRAV，收取細(xì)胞總RNA，通過qRT-PCR檢測(cè)各組IL-6R相對(duì)表達(dá)量；收取細(xì)胞總蛋白，Western blot測(cè)各組IL-6R的表達(dá)量。
　　7.過表達(dá)ln

24、c-NRAV、lnc-NRAVmut、IL-6R或過表達(dá)lnc-NRAV、lnc-NRAVmut的同時(shí)敲低IL-6R的A549或BEAS-2B細(xì)胞感染RSV，感染后48h，收取細(xì)胞總RNA，經(jīng)qRT-PCR檢測(cè)RSV相關(guān)基因相對(duì)表達(dá)量；收取細(xì)胞總蛋白，Western blot檢測(cè)RSV F蛋白的表達(dá)量；收取細(xì)胞上清，病毒空斑試驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞上清中RSV病毒滴度的變化情況。
　　8.敲低lnc-NRAV、IL-6R或敲低lnc-NRAV

25、的同時(shí)過表達(dá)IL-6R的細(xì)胞感染RSV，感染后48h，收取細(xì)胞總RNA，經(jīng)qRT-PCR檢測(cè)RSV相關(guān)基因相對(duì)表達(dá)量；收取細(xì)胞總蛋白，Western blot檢測(cè)RSVF蛋白的表達(dá)量；收取細(xì)胞上清，病毒空斑試驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞上清中RSV病毒滴度的變化情況。
　　結(jié)果：
　　1.Targetscan、miRDB和microRNA三個(gè)數(shù)據(jù)庫預(yù)測(cè)，miR-125a-5p與miR-125b-5p下游靶基因中交集度及評(píng)分值較高的有IL-6R

26、、IRF4、IL-31、CD5L、IL-16、CXCL13。以qRT-PCR驗(yàn)證，IL6-R Ct值為28-29，在A549和BEAS-2B細(xì)胞中有表達(dá)，其余基因Ct值>40（undetected），在細(xì)胞中未檢出。故后續(xù)試驗(yàn)圍繞IL-6R設(shè)計(jì)進(jìn)行。
　　2.雙熒光素酶報(bào)告試驗(yàn)結(jié)果提示，在細(xì)胞中l(wèi)nc-NRAV和IL-6R均可競(jìng)爭(zhēng)性地結(jié)合miR-125a-5p和miR-125b-5p。
　　3.lnc-NRAV和IL-6R的

27、表達(dá)量呈正相關(guān)，均起到促進(jìn)RSV病毒復(fù)制的作用：
　　3.1.過表達(dá)lnc-NRAV組IL-6R的相對(duì)表達(dá)量明顯高于對(duì)照組（P<0.05），過表達(dá) lnc-NRAVmut組IL-6R的相對(duì)表達(dá)量與對(duì)照組相比無明顯差別（P>0.05）。在回復(fù)試驗(yàn)中，過表達(dá)lnc-NRAV的同時(shí)過表達(dá)miR-125a-5p或miR-125b-5p，IL-6R的相對(duì)表達(dá)量與對(duì)照組相比無明顯差別（P>0.05）。
　　3.2.敲低lnc-NRAV組

28、IL-6R的表達(dá)量明顯低于對(duì)照組（P<0.05）。在回復(fù)試驗(yàn)中，同時(shí)敲低lnc-NRAV、miR-125a/b-5p，IL-6R的表達(dá)量回復(fù)至對(duì)照組水平（P>0.05）。
　　3.3.過表達(dá)miR-125a/b-5p組IL-6R的表達(dá)量明顯低于對(duì)照組（P<0.05）。在回復(fù)試驗(yàn)中，同時(shí)過表達(dá)miR-125a/b-5p與lnc-NRAV，IL-6R的表達(dá)量回復(fù)至對(duì)照組水平（P>0.05）。
　　3.4.在以上過表達(dá)細(xì)胞中感染R

29、SV，結(jié)果顯示，過表達(dá)lnc-NRAV組、過表達(dá)IL-6R組RSV相關(guān)基因、F蛋白表達(dá)量及上清中病毒滴度明顯高于對(duì)照組（P<0.05），而過表達(dá)lnc-NRAVmut組則與對(duì)照組相比無明顯差別（P>0.05）；在回復(fù)試驗(yàn)中，過表達(dá) lnc-NRAV的同時(shí)敲低IL-6R，RSV以上指標(biāo)與對(duì)照組相比無明顯差別（P>0.05），而過表達(dá)lnc-NRAVmut的同時(shí)敲低IL-6R，RSV的增殖明顯低于對(duì)照組（P<0.05）。
　　3.5.

30、在分別敲低lnc-NRAV、IL-6R的細(xì)胞中感染RSV，結(jié)果顯示RSV相關(guān)基因、F蛋白的表達(dá)量及上清中病毒滴度均明顯低于對(duì)照組（P<0.05）；在回復(fù)試驗(yàn)中，敲低lnc-NRAV的同時(shí)過表達(dá)IL-6R，則RSV的增殖回復(fù)至對(duì)照組水平（P>0.05）。
　　結(jié)論：
　　1.RSV感染引起呼吸道上皮細(xì)胞lnc-NRAV的表達(dá)下降。
　　2.在呼吸道上皮細(xì)胞中上調(diào)lnc-NRAV能夠促進(jìn)RSV在其中的復(fù)制；下調(diào)lnc-NR