RNAi介導(dǎo)的長鏈非編碼RNA PCAT--1表達(dá)沉默對人結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲、藥物敏感性的影響及機(jī)制研究.pdf

1、目的:
　　本研究通過將Lnc RNA PCAT-1的shRNA干擾質(zhì)粒，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的人結(jié)直腸癌細(xì)胞，探討下調(diào)Lnc RNAP CAT-1的表達(dá)對人結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲及藥物敏感性的影響及相關(guān)生物學(xué)機(jī)制研究。從而推斷Lnc RNA PCAT-1可能成為結(jié)直腸癌治療的一個潛在的新方法和新靶點(diǎn)。
　　方法:
　　1.篩選HT-29和Caco-2細(xì)胞系
　　2.細(xì)胞轉(zhuǎn)染和穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株的篩選和培養(yǎng)
　　

2、3.熒光定量PCR檢測各組細(xì)胞和瘤組織中PCAT-1的表達(dá)水平
　　4.克隆形成實驗檢測各組細(xì)胞的克隆形成
　　5.CCK-8實驗檢測各組細(xì)胞的增殖情況
　　6.流式細(xì)胞術(shù)檢測各組細(xì)胞的細(xì)胞周期及被5-FU處理后的凋亡水平
　　7.Hoechst染色檢測各組細(xì)胞的凋亡情況、被5-FU處理后的凋亡情況及小鼠成瘤的組織形態(tài)
　　8.Western blot實驗檢測各組細(xì)胞的增殖、凋亡指標(biāo)及c-myc的表達(dá)水平<

3、br>　　9.細(xì)胞劃痕實驗檢測各組細(xì)胞的遷移能力
　　10.Transwell實驗檢測各組細(xì)胞的侵襲能力
　　11.明膠酶譜實驗檢測各組細(xì)胞中MMP-2和MMP-9的活性
　　12.MTT實驗檢測各組細(xì)胞中MMP-2和MMP-9的表達(dá)水平及被5-FU處理后細(xì)胞的增殖水平
　　13.裸鼠BALB/c-nu體內(nèi)成瘤實驗檢測各組細(xì)胞體內(nèi)成瘤能力
　　結(jié)果:
　　1.Real-time PCR檢測不同人結(jié)直腸

4、癌細(xì)胞中l(wèi)ncRNA PCAT-1的表達(dá)，HT-29和Caco-2細(xì)胞組表達(dá)較高，P＜0.05，存在顯著性差異，故篩選出HT-29和Caco-2細(xì)胞系作為后續(xù)研究細(xì)胞。
　　2.Real-time PCR檢測穩(wěn)定轉(zhuǎn)染后各組細(xì)胞中PCAT-1的表達(dá)，與對照組和原細(xì)胞組對比，shRNA-PCAT-1組PCAT-1的表達(dá)明顯下調(diào)，P＜0.05，存在顯著性差異，說明干擾質(zhì)粒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞成功。
　　3.克隆形成實驗檢測各組細(xì)胞的克隆形

5、成實驗表明:經(jīng)過各組細(xì)胞15天克隆形成后染色測定，與對照組和原細(xì)胞組對比，shRNA-PCAT-1組的克隆細(xì)胞數(shù)形成明顯減少，說明shRNA-PCAT-1組細(xì)胞增殖能力下降。
　　4.CCK-8檢測各組細(xì)胞的增殖實驗結(jié)果表明:經(jīng)過0h、24h、48h、72h、96h檢測各組細(xì)胞的增殖情況，與對照組和原細(xì)胞組對比，shRNA-P CAT-1組的細(xì)胞增殖數(shù)形成減少，增殖曲線明顯偏離其余兩條曲線，P＜0.05，存在顯著性差異，說明shR

6、NA-PCAT-1組細(xì)胞增殖下降。
　　5.流式細(xì)胞術(shù)檢測各組細(xì)胞的細(xì)胞周期表明:與對照組和原細(xì)胞組對比，shRNA-PCAT-1組的細(xì)胞在G1期細(xì)胞數(shù)增加，S期(DNA合成期)的細(xì)胞數(shù)減少，表明靜止期細(xì)胞數(shù)增加，增殖期細(xì)胞數(shù)目減少，P＜0.05，存在顯著性差異，G2和M期無差異，說明shRNA-PCAT-1組細(xì)胞處于G1期細(xì)胞數(shù)增加，S期的細(xì)胞數(shù)明顯下降，說明shRNA-PCAT-1組細(xì)胞增殖下降。
　　6.Hoechst

7、染色檢測各組細(xì)胞的凋亡情況表明:與對照組和原細(xì)胞組對比，shRNA-PCAT-1組的細(xì)胞凋亡細(xì)胞數(shù)增加，P＜0.05，存在顯著性差異，對照組和原細(xì)胞組比較無差異，說明shRNA-PCAT-1組細(xì)胞凋亡是明顯增加。
　　7.流式細(xì)胞術(shù)檢測各組細(xì)胞的凋亡情況表明:與對照組和原細(xì)胞組對比，shRNA-PCAT-1組的細(xì)胞在UR+LR象限內(nèi)統(tǒng)計的細(xì)胞數(shù)之和明顯增加，P＜0.05，存在顯著性差異，說明shRNA-PCAT-1組細(xì)胞凋亡是明顯

8、增加的。
　　8.細(xì)胞劃痕實驗檢測各組細(xì)胞的遷移能力（12h和24h時間點(diǎn)）:在兩組細(xì)胞的劃痕實驗圖像定量分析結(jié)果顯示，與對照組和原細(xì)胞組對比，shRNA-PCAT-1組細(xì)胞的傷口閉合過程延遲，有顯著差異，P＜0.05，說明shRNA-PCAT-1組細(xì)胞的遷移能力下降。
　　9.Transwell實驗檢測各組細(xì)胞的侵襲能力:在兩組細(xì)胞的Transwell實驗代表圖像定量分析結(jié)果顯示，與對照組和原細(xì)胞組對比，shRNA-PCA

9、T-1組細(xì)胞入侵通過膜下的細(xì)胞數(shù)明顯減少，有顯著差異，P＜0.05，說明shRNA-PCAT-1組細(xì)胞的侵襲能力下降。
　　10.裸鼠體內(nèi)成瘤能力觀察和測定實驗:代表性的圖像和生長曲線分析結(jié)果的表明，與對照組和原細(xì)胞組對比，shRNA-PCAT-1組細(xì)胞的小鼠體內(nèi)成瘤明顯縮小，剖出瘤體直徑縮小，生存曲線明顯偏離其它兩條曲線，有顯著差異，P＜0.05，表明shRNA-PCAT-1組細(xì)胞在小鼠體內(nèi)成瘤能力下降。
　　11.HE染

10、色觀察各組裸鼠體內(nèi)成瘤的組織形態(tài):解剖小鼠體內(nèi)瘤體染色，代表性的圖像表明，與對照組和原細(xì)胞組對比，shRNA-PCAT-1組細(xì)胞的細(xì)胞核染色變淺，瘤細(xì)胞數(shù)減少，細(xì)胞形態(tài)稀疏，有顯著差異，表明shRNA-PCAT-1組細(xì)胞在小鼠體內(nèi)成瘤能力下降。
　　12.Real-time PCR檢測各組裸鼠體內(nèi)成瘤的瘤組織中PCAT-1的表達(dá)水平:Caco-2和HT-29兩組細(xì)胞的小鼠體內(nèi)成瘤，解剖瘤體后Real-time PCR檢測各組瘤組織

11、中PCAT-1的表達(dá)水平，代表性的定量分析結(jié)果的表明，與對照組和原細(xì)胞組對比，shRNA-PCAT-1組細(xì)胞的表達(dá)明顯下降，有顯著差異，P＜0.05。
　　13.Western blot實驗檢測各組細(xì)胞的c-myc的表達(dá)水平:在c-myc過表達(dá)質(zhì)粒干擾前各組細(xì)胞的結(jié)果表明，與對照組和原細(xì)胞組對比，shRNA-PCAT-1組細(xì)胞的c-myc表達(dá)明顯下降，有顯著差異，P＜0.05，說明shRNA-PCAT-1組細(xì)胞中c-myc原癌基因

12、表達(dá)下降;在c-myc過表達(dá)質(zhì)粒干擾后各組細(xì)胞的結(jié)果表明，control+c-myc組與control+control組之間統(tǒng)計有顯著差異，P＜0.05，vector-PCAT-1+c-myc組與vector-PCAT-1+control組之間統(tǒng)計有顯著差異，P＜0.05。說明c-myc原癌基因能夠誘導(dǎo)提高shRNA-PCAT-1組細(xì)胞中的c-myc表達(dá)，從而說明PCAT-1的功能作用依賴于c-myc。
　　14.Transwel

13、l實驗檢測各組細(xì)胞的侵襲能力:在-myc過表達(dá)質(zhì)粒干擾后各組細(xì)胞的結(jié)果代表圖像定量分析結(jié)果顯示control+c-myc組與control+control組之間統(tǒng)計有顯著差異，P＜0.05，vector-PCAT-1+c-myc組與vector-PCAT-1+control組之間統(tǒng)計有顯著差異，P＜0.05。說明c-myc原癌基因誘導(dǎo)提高shRNA-PCAT-1組細(xì)胞的侵襲能力，從而說明PCAT-1的功能作用依賴于c-myc。
　

14、　15.MTT實驗檢測各組細(xì)胞中被5-FU處理48h后的增殖水平，計算各組細(xì)胞的IC50:分別用不同濃度的5-氟尿嘧啶(5-FU)(0、5、10、15、25、50、100μg/ml)處理parental、control、vector-PCAT-1細(xì)胞48h，定量分析結(jié)果顯示，與對照組和原細(xì)胞組對比，shRNA-PCAT-1組細(xì)胞的在不同濃度5-FU處理后，細(xì)胞增殖水平明顯下降，有顯著差異，P＜0.05，說明shRNA-PCAT-1組細(xì)胞

15、對5-FU的藥物敏感性升高。并計算HT-29的IC50為7.330μg/ml和Caco-2的IC50為2.428μg/ml。
　　16.MTT實驗檢測各組細(xì)胞中被IC50濃度5-FU處理后的增殖水平:定量分析結(jié)果顯示，與對照組和原細(xì)胞組對比，shRNA-PCAT-1組細(xì)胞的IC50濃度5-FU處理后，細(xì)胞增殖水平明顯下降，細(xì)胞增殖曲線向下偏移，有顯著差異，P＜0.05，說明shRNA-PCAT-1組細(xì)胞對IC50濃度5-FU的藥物

16、敏感性升高。
　　17.流式細(xì)胞術(shù)檢測各組細(xì)胞被IC50濃度的5-FU處理后的凋亡水平:代表性的圖像與定量分析結(jié)果顯示，與對照組和原細(xì)胞組對比，shRNA-PCAT-1組的細(xì)胞凋亡數(shù)目明顯增多，存在顯著性差異，P＜0.05，對照組和原細(xì)胞組比較無差異，說明shRNA-PCAT-1組細(xì)胞凋亡是明顯增多，細(xì)胞對IC50濃度5-FU的藥物敏感性升高。
　　18.Hoechst染色檢測各組細(xì)胞被IC50濃度5-FU處理后的凋亡情況:

17、與對照組和原細(xì)胞組對比，shRNA-PCAT-1組的細(xì)胞凋亡細(xì)胞數(shù)增加，P＜0.05，存在顯著性差異，對照組和原細(xì)胞組比較無差異，說明shRNA-PCAT-1組細(xì)胞對IC50濃度5-FU的藥物敏感性升高。
　　結(jié)論:
　　1.Lnc RNA PCAT-1的沉默抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖。
　　2.Lnc RNA PCAT-1的沉默促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞的凋亡。
　　3.Lnc RNA PCAT-1沉默抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的遷移