BNIP3對(duì)結(jié)直腸癌化療敏感性影響及其表達(dá)調(diào)控研究.pdf

1、結(jié)直腸癌(colorectal cancer,CRC)是一種常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤,化療在其治療手段中占有重要地位。腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的耐受嚴(yán)重影響了化療效果,其中凋亡通路的障礙是導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物耐受的重要原因之一。Bcl-2家族蛋白是介導(dǎo)化學(xué)藥物等細(xì)胞毒性信號(hào)刺激引起內(nèi)源性凋亡途徑的重要蛋白。當(dāng)細(xì)胞受到這些信號(hào)刺激時(shí),細(xì)胞是否凋亡很大程度上取決于Bcl-2家族中促凋亡蛋白和抗凋亡蛋白力量的平衡。
　　 BNIP3(Bcl

2、-2/adenovirus E1B19 kDa-interacting protein3)是Bcl-2家族中重要的促凋亡成員,它通過與抗凋亡蛋白Bcl-2、Bcl-x1等形成異二聚體而拮抗其功能,或直接作用于線粒體外膜導(dǎo)致線粒體功能障礙,從而引起細(xì)胞凋亡(apoptosis)。此外,BNIP3還可以誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生壞死樣(necrosis-like)死亡和自噬性(autophagy)死亡。BNIP3在結(jié)直腸癌、胰腺癌和部分血液系統(tǒng)惡性腫瘤中

3、表達(dá)降低或缺失,而且BNIP3的表達(dá)降低或缺失與胰腺癌對(duì)化療抵抗有關(guān)。這提示,BNIP3的失活可能是導(dǎo)致惡性腫瘤細(xì)胞凋亡信號(hào)通路受阻、逃逸化療藥物誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡,從而對(duì)化療藥物產(chǎn)生耐受的重要因素之一。但是,BNIP3的表達(dá)對(duì)結(jié)直腸癌化療敏感性的確切影響尚不清楚。
　　 BNIP3的表達(dá)沉默受基因啟動(dòng)子異常甲基化調(diào)控。DNA甲基化由DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNA methyltransferase,DNMT)催化完成,具有催化甲基化功能

4、的主要的DNMT有DNMT1、DNMT3a及DNMT3b。BNIP3表達(dá)沉默的腫瘤細(xì)胞用DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑5-雜氮脫氧胞嘧啶(5-aza-deoxycytidine,5-aza-dC)處理,可恢復(fù)BNIP3的表達(dá)。因此,有望通過采用去甲基化手段,恢復(fù)BNIP3表達(dá),促進(jìn)細(xì)胞凋亡,增加結(jié)直腸癌等BNIP3表達(dá)沉默的腫瘤對(duì)化療藥物的敏感性。但是DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑由于在DNA合成過程中摻入DNA,可能導(dǎo)致DNA損傷而存在廣泛的細(xì)胞毒性

5、,以及治療的非特異性而限制了其應(yīng)用。
　　 RNA干擾是近年發(fā)展起來的使靶基因沉默的一種技術(shù),它主要通過降解靶基因mRNA來實(shí)現(xiàn)敲除或失活相應(yīng)基因的目的,具有良好的特異性及干擾效果,在臨床靶向治療中有著良好的應(yīng)用前景。既往研究證實(shí),應(yīng)用RNA干擾手段單獨(dú)抑制DNMT1表達(dá)或聯(lián)合沉默DNMT1和DNMT3b的表達(dá)可以使腫瘤細(xì)胞高甲基化的抑癌基因啟動(dòng)子將不同程度地去甲基化,受甲基化控制的抑癌基因?qū)⒌玫讲煌潭鹊谋磉_(dá)。但是干擾DNMT

6、s對(duì)BNIP3基因的去甲基化作用以及對(duì)結(jié)腸癌化療敏感性的影響目前尚不清楚。
　　 本文擬通過檢測(cè)結(jié)直腸癌組織標(biāo)本BNIP3的表達(dá)并分析其與臨床化療療效的相關(guān)性,通過干擾結(jié)腸癌細(xì)胞株BNIP3表達(dá),觀察結(jié)腸癌細(xì)胞增殖、藥物誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡和化療敏感性的變化,以進(jìn)一步探討B(tài)NIP3對(duì)結(jié)直腸癌化療的確切影響;擬通過檢測(cè)結(jié)腸癌細(xì)胞株BNIP3基因啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)證實(shí)基因啟動(dòng)子異常甲基化是導(dǎo)致BNIP3沉默的重要機(jī)機(jī)制,應(yīng)用RNAi技術(shù)干擾

7、DNMT1和DNMT3b的表達(dá),檢測(cè)BNIP3的表達(dá)和甲基化狀態(tài)的改變,以及結(jié)腸癌細(xì)胞增殖、凋亡和化療敏感性的變化,以進(jìn)一步探討RNA干擾DNMT1和DNMT3b的表達(dá)能否通過去甲基化作用恢復(fù)BNIP3的表達(dá),增加結(jié)腸癌細(xì)胞的化療敏感性。
　　 方法
　　 1、應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)81例應(yīng)用“奧沙利鉑聯(lián)合5-Fu/CF”方案化療的晚期結(jié)直腸癌患者腫瘤組織和遠(yuǎn)殘端正常結(jié)直腸組織標(biāo)本BNIP3的表達(dá)。
　　 2、

8、采用RT-PCR和Western印跡法檢測(cè)八種人結(jié)腸癌細(xì)胞株BNIP3基因mRNA和蛋白表達(dá)。
　　 3、構(gòu)建靶向BNIP3基因的短發(fā)夾RNA(short hairpin RNA,shRNA)真核表達(dá)載體(pGCsi3.0-BNIP3),轉(zhuǎn)染結(jié)腸癌LoVo細(xì)胞,篩選穩(wěn)定表達(dá)克隆。
　　 4、采用RT-PCR和Western印跡法檢測(cè)DNMT1和DNMT3b在八種人結(jié)腸癌細(xì)胞株的表達(dá)。
　　 5、選擇DNMT1和D

9、NMT3b高表達(dá)而BNIP3表達(dá)沉默的結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞作為細(xì)胞模型,單獨(dú)或聯(lián)合轉(zhuǎn)染化學(xué)合成DNMT1 siRNA和DNMT3b siRNA,并用DNMT抑制劑5-aza-dC作為陽性對(duì)照。
　　 結(jié)果
　　 1、結(jié)直腸腫瘤組織中的BNIP3免疫積分顯著低于正常結(jié)直腸組織(1.8±8).2v3.7±0.5,P＜0.05)。腫瘤組織BNIP3的表達(dá)與HIF-1α表達(dá)無相關(guān)性。
　　 2、在人結(jié)腸癌八種細(xì)胞株中HC

10、T-116、LS174T和LoVo三種細(xì)胞有明顯BNIP3表達(dá),低氧處理24h后BNIP3的表達(dá)較常氧培養(yǎng)條件下明顯增強(qiáng)。
　　 3、RNAi技術(shù)可特異性沉默LoVo細(xì)胞BNIP3基因表達(dá),mRNA和蛋白水平表達(dá)抑制率分別為73.1％和75.4％。
　　 4、抑制BNIP3基因表達(dá)使LoVo細(xì)胞體外生長(zhǎng)增殖速度明顯加快。與對(duì)照組LoVo細(xì)胞相比,BNIP3 RNAi的LoVo細(xì)胞5-FU誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡率顯著減少(8.35

11、±0.46v19.75±2.37,P＜0.05),5-FU作用的IC50值顯著增高(108.4±4.69ug/mlv50.08±2.85μg/ml,P＜0.05)。
　　 5、DNMT1在八種人結(jié)腸癌細(xì)胞株中均高表達(dá),DNMT3b差異性明顯表達(dá)。
　　 6、應(yīng)用siRNA可特異性沉默HT-29細(xì)胞DNMT1和DNMT3b基因表達(dá),蛋白水平表達(dá)抑制率分別為76.0％和71.1％。
　　 7、單獨(dú)應(yīng)用DNMT1siR

12、NA和聯(lián)合應(yīng)用DNMT1 siRNA、DNMT3b siRNA使BNIP3基因啟動(dòng)子去甲基化,誘導(dǎo)BNIP3的表達(dá)。聯(lián)合應(yīng)用DNMT1 siRNA、DNMT3b siRNA較單獨(dú)應(yīng)用DNMT1siRNA的作用更顯著,聯(lián)合應(yīng)用與1uM5-aza-dC作用相當(dāng)。而單獨(dú)應(yīng)用DNMT3BsiRNA和陰性對(duì)照組HT-29細(xì)胞BNIP3基因啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)和BNIP3的表達(dá)無明顯影響。
　　 8、單獨(dú)應(yīng)用DNMT1siRNA和聯(lián)合應(yīng)用DNM

13、T1 siRNA、DNMT3b siRNA使HT-29細(xì)胞體外克隆形成能力明顯下降,細(xì)胞克隆形成率分別為(15.4±3.7)％和(2.1±0.43)％,與陰性對(duì)照組(25.8±5.1)％比較有顯著差異。與陰性對(duì)照組HT-29細(xì)胞相比,單獨(dú)應(yīng)用DNMT1siRNA和聯(lián)合應(yīng)用DNMT1siRNA、DNMT3b siRNA的HT-29細(xì)胞其G0/G1期細(xì)胞數(shù)分別增加21.72％and28.33％,S期的細(xì)胞數(shù)分別減少30.86％and44.5

14、6％,細(xì)胞凋亡率分別增加6.1 and13.34倍(P＜0.05)。與陰性對(duì)照組HT-29細(xì)胞IC50值比較,單獨(dú)應(yīng)用DNMT1siRNA和聯(lián)合應(yīng)用DNMT1 siRNA、DNMT3b siRNA的HT-29細(xì)胞5-FU的IC50值均顯著降低(171.5±15.20μg/mlv376.5±33.69μg/ml,45.54±12.88μg/ml v376.5±33.69μg/ml,P均＜0.05)。聯(lián)合應(yīng)用DNMT1 siRNA、DNMT

15、3b siRNA組的HT-29細(xì)胞克隆形成能力、細(xì)胞凋亡率和5-Fu的IC50值的改變較單獨(dú)轉(zhuǎn)染DNMT1 siRNA組均更顯著(JP均＜0.05)。單獨(dú)應(yīng)用DNMT3b siRNA和陰性對(duì)照對(duì)HT-29細(xì)胞克隆形成能力、細(xì)胞凋亡率和5-FU的IC50值均無顯著改變。
　　 結(jié)論
　　 1.BNIP3在結(jié)腸癌組織和細(xì)胞中表達(dá)降低或沉默,基因啟動(dòng)子異常甲基化是BNIP3表達(dá)下調(diào)的重要原因。
　　 2.BNIP3表達(dá)

16、與晚期結(jié)直腸癌患者FOLFOX方案化療療效相關(guān)。阻斷結(jié)腸癌細(xì)胞BNIP3基因表達(dá),可通過促進(jìn)細(xì)胞增殖,減少5-Fu藥物誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡,來降低結(jié)腸癌細(xì)胞對(duì)5-FU的敏感性。這提示BNIP3可能是結(jié)直腸癌治療的潛在靶點(diǎn)。
　　 3.RNAi技術(shù)可特異性抑制DNMT1和DNMT3b基因表達(dá)。雙重干擾DNMT1、DNMT3b表達(dá)或單獨(dú)干擾DNMT1表達(dá)可通過基因啟動(dòng)子去甲基化作用誘導(dǎo)HT-29細(xì)胞BNIP3表達(dá),同時(shí)還可降低HT-29細(xì)