軟骨細胞中成纖維細胞生長因子對長鏈非編碼RNA Malat1的影響.pdf

1、骨骼是人類最大的器官。骨骼的生長發(fā)育是一個復雜的過程，其生長方式主要有兩種，即膜內成骨與軟骨內成骨。其中軟骨內成骨是軀干骨，四肢長骨，以及部分不規(guī)則短骨生長的主要方式，膜內成骨則是頂骨，額骨和鎖骨等骨骼的主要形成方式。軟骨內成骨在胚胎發(fā)育過程及長骨形成等方面發(fā)揮重要的作用，目前公認成纖維細胞生長因子（Fibroblast growth factor，FGF）信號通路在軟骨內成骨過程中發(fā)揮著重要的調控作用。
　　成纖維細胞生長因子家

2、族由22個成員組成，目前認為FGF2是其中表達最廣泛的細胞因子。成纖維細胞生長因子通過與細胞膜上的成纖維細胞生長因子受體(Fibroblast growth factor receptor，FGFR)激活下游多種通路，產生一系列效應。在小鼠模型及人類病例中，FGFR點突變能引起多種類型的侏儒。在軟骨細胞中，FGF信號通路能抑制細胞增殖。目前關于FGF信號通路所影響的下游蛋白分子已有很多研究，但在軟骨組織中FGF信號通路是否通過影響非編碼

3、蛋白RNA從而發(fā)揮其對軟骨細胞的調控作用，尚沒有得到很好的研究。
　　近年來對非編碼RNA(non-coding RNA，ncRNA)在胚胎發(fā)育，正常生理過程及疾病過程中的作用認識日益加深。非編碼RNA不編碼成蛋白質，以其它方式發(fā)揮作用。長鏈非編碼RNAs(Long non-coding RNAs)是指轉錄長度超過200個堿基對的ncRNA，在物種間保守性不高，通過多種途徑調控基因的表達。Malat1是一個在哺乳動物中高度保守存在

4、的LncRNA，最初在關于非小細胞肺癌的篩選性研究中被發(fā)現。之后發(fā)現幾乎所有的腫瘤細胞中Malat1均有高表達，大量腫瘤學研究表明Malat1對多種腫瘤細胞具有促侵襲和促轉移作用。Malat1在成骨細胞增殖，骨肉瘤增殖侵襲等方面具有促進作用，這些研究表明在骨骼中，Malat1可能發(fā)揮一定的作用，但其在軟骨細胞中有無作用尚不清楚，在軟骨發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用的FGF信號是否與Malat1有聯(lián)系目前也不清楚。
　　目的:
　　本

5、實驗室在FGF信號通路對軟骨的調控方面做了很多研究，積累了良好的基礎。關于FGF信號通路所影響的下游蛋白分子已有很多研究，但在軟骨組織中FGF信號通路是否通過影響非蛋白類分子，比如LncRNAs，從而發(fā)揮其對軟骨細胞的調控作用，尚不十分清楚。
　　因此我們首先以小鼠原代軟骨細胞，小鼠軟骨前體細胞系ATDC5，人類正常軟骨細胞C28I2作為細胞模型，檢測了Malat1在軟骨細胞中的基礎表達水平，我們的結果表明Malat1在小鼠和人的

6、軟骨細胞中均呈現高豐度表達，這樣高的基礎水平提示Malat1在軟骨細胞中可能發(fā)揮著重要的生物學功能。因此在本課題中，我們利用小片段干擾RNA技術干擾了Malat1的表達水平，初步研究Malat1對軟骨細胞的作用。為了探究FGF信號通路是否調控Malat1的表達，我們進一步利用重組FGF2結合相關通路阻斷劑處理小鼠原代軟骨細胞，小鼠及人類軟骨細胞系模型，探討了FGF2信號通路是否可以通過調控Malat1的表達調節(jié)軟骨細胞增殖。
　　

7、方法:
　　1.Malat1在軟骨細胞中的基礎表達水平
　　1.1分離C57小鼠新生幼崽（日齡3～5日）原代軟骨，接種培養(yǎng)48h后提取RNA，利用qPCR檢測Malat1的表達水平。
　　1.2培養(yǎng)小鼠成纖維細胞系NIH3T3，小鼠軟骨前體細胞系ATDC5，人正常軟骨細胞系C28I2，以及人骨肉瘤細胞系SW1353，24h及48h后提取RNA并檢測Malat1的表達水平。
　　2.Malat1對ATDC5軟骨細胞

8、系增殖的影響
　　2.1設計數條針對小鼠Malat1基因的siRNA并通過熒光指示劑和qPCR篩選出最有效的siRNA。
　　2.2將siRNA轉染至ATDC5細胞并通過細胞計數研究Malat1敲減對ATDC5細胞增殖速度的影響。
　　3.FGF2對軟骨細胞中Malat1表達水平的影響
　　3.1用FGF2處理C57小鼠原代軟骨細胞，及ATDC5細胞，在處理后不同時間點提取RNA，qPCR測定Malat1的表達水

9、平，以未處理組作為對照組。
　　3.2用ERK通路抑制劑U0126單獨或與FGF2共同處理ATDC5細胞，在處理后24h收取RNA，qPCR檢測Malat1的表達水平，以未處理組作為對照組。
　　3.3從本科室保育的β-catenin小鼠中分離原代軟骨細胞并培養(yǎng)，48h后收取細胞并提取RNA，qPCR檢測Malat1表達水平的變化，以未敲除組作為對照組。
　　3.4從本科室保育的FGFR1Co12陽性細胞特異性敲除小鼠

10、及FGFR3系統(tǒng)性敲除小鼠中分離原代軟骨細胞并培養(yǎng)，48h后收取細胞并提取RNA，qPCR檢測Malat1表達水平的變化，以同窩未敲除幼崽作為對照組。
　　3.5設計針對Fgfr1的siRNA，并構建和制備Myc-Fgfr1質粒，確認其工作效率后將兩者轉入ATDC5細胞，24h后利用qPCR技術檢測Malat1表達水平的變化，以未處理組作為對照組。
　　結果:
　　1.Malat1在多種軟骨細胞系中的表達豐度。

11、　　我們首先利用qPCR檢測了NIH3T3細胞中Malat1的基礎表達水平，以其作為參照，結果提示Malat1在C57小鼠原代軟骨細胞，小鼠軟骨細胞系ATDC5，人正常軟骨細胞系C28I2及人骨肉瘤細胞系SW1353中均為高豐度基礎表達。在ATDC5細胞中，24h及48h時間點Malat1的基礎表達水平無明顯差異。
　　2.敲減Malat1對ATDC5細胞的增殖速度的影響。
　　用si-Malat1轉染細胞，觀察共轉染的熒光

12、指示劑，結果提示si-Malat1已經被成功轉染到ATDC5細胞中;收取細胞RNA，利用qPCR檢測，結果發(fā)現Malat1的表達水平被成功干擾，干擾效率超過50％;si-Malat1轉染細胞后多個時間點進行細胞計數，以未處理組作為對照組，結果表明Malat1被干擾后，ATDC5細胞的增殖速度出現了明顯下降。
　　3.FGF信號對Malat1的調控。
　　用FGF2處理C57小鼠原代軟骨細胞，小鼠軟骨細胞系ATDC5，人正常軟

13、骨細胞系C28I2及人骨肉瘤細胞系SW1353，24h后收取細胞提取RNA，進行qPCR檢測。以未處理組作為對照組，結果發(fā)現在上述細胞中，FGF2處理均明顯抑制了Malat1的表達水平。在ATDC5細胞中進行多濃度和多時間點FGF2處理，提取RNA后qPCR檢測，結果提示FGF2對ATDC5細胞中Malat1的抑制作用無劑量依賴效應，在24h即已生效，持續(xù)時間可達24小時以上。
　　利用本科室保育的β-catenin Co12陽性

14、細胞特異性敲除小鼠幼仔分離原代軟骨細胞培養(yǎng)，利用qPCR檢測Malat1的表達水平，以未敲除組作為對照組，發(fā)現Malat1的表達水平未發(fā)生明顯變化。
　　利用ERK信號通路抑制劑U0126單獨處理或與FGF2共同處理ATDC5細胞，收取RNA進行qPCR檢測，結果表明ATDC5細胞經U0126處理后，Malat1的表達水平顯著提高，且FGF2與U0126共同處理時，FGF2不能抑制Malat1的表達水平。提示FGF2對Malat1

15、的抑制可能是通過FGF受體激活下游ERK通路完成的。
　　利用本科室保育的FGFR1條件性敲除小鼠及FGFR3敲除小鼠幼仔分離原代軟骨細胞培養(yǎng)，利用qPCR檢測Malat1的表達水平，以未敲除組作為對照組，發(fā)現在FGFR3敲除小鼠原代軟骨中，Malat1的基礎表達水平未發(fā)生明顯變化，同時，Fgfr3敲除的小鼠幼仔原代軟骨經FGF2處理后，Malat1的表達仍然是下調的;在FGFR1條件性敲除小鼠的原代軟骨中，Malat1的基礎表達

16、水平顯著上升，并且在條件性敲除Fgfr1的小鼠原代軟骨中，與對照組相比，FGF2處理不能再抑制Malat1的表達。與此同時，我們設計了針對Fgfr1的siRNA，并構建制備了Myc-Fgfr1質粒，將siRNA及Fgfr1質粒分別轉入ATDC5細胞中，24h后收取RNA進行qPCR檢測，結果提示Fgfr1表達水平被干擾后，Malat1的表達水平明顯增高，同時，與FGF2處理的空白對照組相比，Fgfr1被干擾后FGF2不能有效地抑制Mal