成纖維細胞生長因子21對骨骼肌肌纖維類型的影響及其機制研究.pdf

1、肌纖維是構成肌肉組織的基本單位，其組成決定肉品質。成纖維細胞生長因子21（Fibroblast growth factor，FGF21）是一種代謝調節(jié)因子，在肌肉中有表達，但其對肌纖維類型的影響尚無相關研究。本試驗以小鼠和C2C12細胞系為模型，旨在考察FGF21對肌纖維類型的影響，并探索其信號轉導機制，以期為營養(yǎng)手段改善肉品質提供調控靶點和理論依據。主要研究如下:
　　試驗一 禁食對小鼠骨骼肌FGF21表達和肌纖維類型的影響

2、r>　　本試驗旨在考察禁食對小鼠骨骼肌FGF21表達和肌纖維類型的影響。試驗選取16只平均體重20g左右的雄性健康C57BL/6小鼠，按體重相近原則隨機分為2個組(n=8)，即對照組和禁食組。小鼠禁食24h后，乙醚麻醉，摘除眼球取血，分離血清待測。頸椎脫位處死小鼠后，取肝臟、比目魚肌、腓腸肌和趾長伸肌待測。結果表明:正常小鼠比目魚肌FGF21 mRNA和蛋白水平顯著高于趾長伸肌和腓腸肌(P＜0.05)。禁食顯著提高了比目魚肌和腓腸肌FG

3、F21 mRNA和蛋白表達(P＜0.05)，但趾長伸肌FGF21 mRNA和蛋白表達無顯著變化（P＞0.1）。禁食條件下，比目魚肌和腓腸肌MyHCⅠ mRNA表達顯著升高（P＜0.05）;腓腸肌MyHCⅡa、MyHCⅡx mRNA表達顯著升高（P＜0.05）;趾長伸肌MyHCⅠ mRNA表達無顯著變化(P＞0.1)，但MyHCⅡa、MyHCⅡx mRNA表達顯著升高(P＜0.05)。本試驗結果表明，禁食提高了比目魚肌和腓腸肌FGF21

4、mRNA和蛋白表達以及氧化型肌纖維的組成，但對趾長伸肌中FGF21 mRNA和蛋白表達以及氧化型肌纖維的組成無顯著影響。
　　試驗二 FGF21處理對小鼠骨骼肌肌纖維類型的調控作用
　　本試驗旨在考察FGF21處理對小鼠骨骼肌肌纖維類型的調控作用。試驗選用16只6周齡的健康雄性C57BL/6小鼠，按體重隨機分為2個處理，每個處理8個重復，每個重復1只小鼠。處理組小鼠按照0.2mg/kg的體重腹腔注射FGF21，連續(xù)注射7d，

5、每天一次，對照組注射等量生理鹽水。試驗結束時，摘除眼球取血，分離血清，采集肝臟、比目魚肌、腓腸肌和趾長伸肌樣品待測。結果表明:小鼠連續(xù)腹腔注射FGF21重組蛋白，血清FGF21水平顯著提高(P＜0.05)，比目魚肌和趾長伸肌FGF21 mRNA表達顯著降低(P＜0.05)，而腓腸肌FGF21 mRNA表達無顯著變化（P＞0.1）。FGF21連續(xù)注射7d后，比目魚肌MyHCⅠ、MyHCⅡa、MyHCⅡx mRNA表達顯著提高(P＜0.05

6、)，而MyHCⅡb mRNA表達顯著降低(P＜0.05);腓腸肌MyHCⅡa mRNA表達顯著提高（P＜0.05），MyHCⅠ、MyHCⅡx和MyHCⅡb mRNA表達無顯著變化(P＞0.1);趾長伸肌MyHCⅠ和MyHCⅡx mRNA表達顯著降低(P＜0.05)，MyHCⅡa和MyHCⅡbmRNA表達無顯著變化（P＞0.1）。此外，通過試驗發(fā)現，FGF21腹腔注射使得比目魚肌FGF21作用受體FGFR1和FGFR4 mRNA表達顯著提

7、高(P＜0.05)，KLB mRNA表達無顯著變化(P＞0.1)。FGF21連續(xù)處理7d顯著提高了腓腸肌FGFR1 mRNA表達(P＜0.05)，FGFR4 mRNA表達有升高的趨勢（0.05＜P＜0.1），而KLB mRNA表達有降低的趨勢（0.05＜P＜0.1）。趾長伸肌FGFR1 mRNA表達顯著降低(P＜0.05)，FGFR4 mRNA表達無顯著變化，而KLB表達顯著提高(P＜0.05)。FGF21注射顯著提高了比目魚肌PGC1

8、α mRNA表達(P＜0.05)，腓腸肌PGCⅠα表達無顯著變化（P＞0.1），而趾長伸肌PGC1α mRNA表達顯著降低(P＜0.05)。上述試驗結果表明，腹腔注射FGF21改變了肌纖維類型，FGF21可能是通過與受體結合調節(jié)PGC1α表達實現此功能的。
　　試驗三 FGF21影響小鼠骨骼肌肌纖維類型的信號轉導機制
　　本試驗旨在通過體外試驗研究FGF21影響小鼠骨骼肌肌纖維類型的信號轉導機制。試驗采用C2C12細胞系為研

9、究對象，待細胞分化為肌管時，添加FGF21進行處理，收集樣品測定發(fā)現，FGF21處理顯著降低了C2C12肌管細胞FGF21 mRNA表達(P＜0.05)。通過免疫熒光研究發(fā)現，FGF21顯著提高慢速氧化型肌纖維的組成比例，降低了快速酵解型肌纖維的組成比例（P＜0.05）。熒光定量PCR測定發(fā)現，FGF21處理顯著提高了C2C12肌管細胞MyHCⅠ mRNA表達(P＜0.05)，而MyHCⅡx mRNA表達有升高的趨勢（0.05＜P＜0.

10、1），MyHCⅡa mRNA表達無顯著變化（P＞0.1），但MyHCⅡb mRNA表達顯著降低(P＜0.05)，表明FGF21可以促使肌管中的Ⅱb型肌纖維向Ⅰ型肌纖維轉化。AMPK-PGC1α信號途徑是經典的調節(jié)肌纖維類型轉化的信號途徑，那么AMPK-PGC1α信號通路是否介導了FGF21對肌纖維類型轉化的調節(jié)作用還不清楚，我們通過熒光定量PCR測定了PGC1α mRNA表達，結果發(fā)現，在調節(jié)肌纖維類型轉化中具有重要作用的PGC1αmR

11、NA表達顯著提高（P＜0.05），于是，我們假設AMPK-PGC1α信號通路介導了FGF21對肌纖維類型轉化的影響，并進行了試驗驗證。試驗首先加入AMPK激活劑Aicar進行研究，研究發(fā)現，FGF21和Aicar分別單獨添加顯著提高了MyHCⅠ mRNA表達(P＜0.05)，顯著降低了MyHCⅡb mRNA表達(P＜0.05)，Aicar和FGF21同時加入對MyHCⅠ和MyHCⅡb mRNA的影響并未呈現出疊加效應。而FGF21和Ai

12、car分別單獨添加顯著提高了PGC1αmRNA表達(P＜0.05)，二者同時加入，與FGF21和Aicar分別單獨加入相比，PGC1αmRNA表達無顯著提高。通過加入AMPK抑制劑，免疫熒光染色統(tǒng)計分析發(fā)現，FGF21提高慢速氧化型肌纖維的組成比例，降低快速酵解型肌纖維的組成比例的效應被AMPK抑制劑CC抑制。熒光定量研究表明，FGF21顯著提高了MyHCⅠ mRNA表達（P＜0.05），CC處理后添加FGF21則降低了MyHCⅠ mR

13、NA表達(P＜0.05)。Westem blot研究發(fā)現，FGF21顯著提高了pAMPK和PGC1α蛋白表達以及pAMPK/AMPK水平，加入AMPK抑制劑后添加FGF21，FGF21升高pAMPK和PGC1α蛋白表達以及pAMPK/AMPK水平的效應被抑制。說明AMPK-PGC1α信號通路介導了FGF21對肌纖維類型的調節(jié)作用。
　　綜上所述，禁食改變了比目魚肌和腓腸肌的肌纖維組成和FGF21表達， FGF21可以通過與細胞膜上