膠原肽的制備及其促進成骨細胞增殖分化活性研究.pdf

1、膠原蛋白是骨有機基質(zhì)的重要組成部分,其水解產(chǎn)物膠原肽具有促進氨基酸吸收和蛋白質(zhì)合成、抗骨質(zhì)疏松、降血壓、抗氧化等生理活性。本文利用水產(chǎn)加工副產(chǎn)物羅非魚皮為原料制備膠原肽,通過研究膠原蛋白肽的制備工藝,探究膠原肽促進成骨細胞增殖分化活性,以期獲得具有特定功效的膠原肽產(chǎn)品,提高羅非魚副產(chǎn)物的附加值。
　　文章分析了羅非魚皮原料的基本組成。魚皮干基中蛋白質(zhì)占90.30％,其中膠原蛋白含量占總蛋白66.90%。采用石油醚脫脂48h以凈化膠

2、原基質(zhì),脫脂率達62.2%。比較四種商品酶制劑對羅非魚皮的水解能力,其中動物蛋白酶和風(fēng)味酶水解度較高。采用正交實驗分別對兩種酶水解條件優(yōu)化,結(jié)果顯示兩種酶最適水解條件一致。采用動物蛋白酶和風(fēng)味酶雙酶復(fù)合水解,酶用量均為4000U/g蛋白,在55℃、pH7.5下對羅非魚皮水解不同時間(5h、8h、22h),比較所得膠原肽(H5、H8、H22)對大鼠成骨細胞增殖分化活性的影響,以Ⅰ型膠原酶酶解羅非魚皮5.5h制得的膠原肽 Hc為陽性對照。結(jié)

3、果表明,隨酶解時間延長,膠原肽促進成骨細胞增殖活性提高,其中H8、H22(1mg/mL)增殖率分別為140.35%和144.21%,兩者差異不顯著,但與空白對照組有顯著差異;同時兩者對成骨細胞分化均具有一定的促進作用。
　　對H5、H8、H22的水解度、相對分子質(zhì)量分布和氨基酸組成進行分析。結(jié)果顯示,隨酶解時間延長,水解度提高,相對分子質(zhì)量降低,H5、H8、H22相對分子質(zhì)量小于1000Da的組分分別占94.73%、95.56%、

4、97.58%,平均相對分子質(zhì)量分別為351.39Da、324.67Da、253.06Da。同時,H5、H8、H22的氨基酸組成較接近,符合典型水產(chǎn)膠原蛋白的氨基酸組成,但也有一定的差異,脯氨酸的含量逐漸降低,羥脯氨酸含量增多。
　　將H8先采用截留分子量為800-1000Da納濾膜進行分級,收集滲透液1(Permeate1,P1)和截留液1(Retentate1,R1),比較兩者活性強弱;將活性強的組分用截留分子量為400-600

5、Da納濾膜進行分級,收集滲透液2(Permeate2,P2)和截留液2(Retentate2,R2),比較兩者活性強弱。結(jié)果表明與R1相比,P1促進成骨細胞增殖分化活性較強,細胞增殖率和分化促進率分別達126.92%和131.77%。R2與P2對成骨細胞增殖分化均有一定的促進作用,但P2活性更強,細胞增殖率和分化促進率分別達130.48%和120.72%,均達到了Hc的活性水平。
　　對R2、P2的相對分子質(zhì)量分布和氨基酸組成進行

6、分析。結(jié)果顯示,兩者存在較大差異。P2相對分子質(zhì)量小于1000Da的組分占98.65%,平均相對分子質(zhì)量為184.62Da;R2相對分子質(zhì)量小于1000Da的組分占96.14%,平均相對分子質(zhì)量為319.59Da。氨基酸組成方面,P2中甘氨酸和丙氨酸共占67.2%,其余氨基酸中只有脯氨酸含量超過5%,達到6.1%,另外膠原蛋白的特征氨基酸羥賴氨酸含量增加了125%;R2中除脯氨酸含量增加了30%、羥賴氨酸增加100%外,其他均與H8接近