脂聯(lián)素(gAdiponectin)的大量制備及其調(diào)控成骨細(xì)胞分化的功能研究.pdf

1、脂肪組織是人體最大的能量?jī)?chǔ)存庫。在機(jī)體需要能量時(shí),脂肪組織動(dòng)用儲(chǔ)存的脂肪,向機(jī)體供能。近來的研究發(fā)現(xiàn)脂肪組織也是一個(gè)極其重要的內(nèi)分泌器官。Adiponectin就是由脂肪組織分泌的一種活性多肽,又名GBP28(gelatinbindingprotein28)、adipoQ、apM1(Adiposemostgenetranscript1)、Acrp30(adipocytecomplementrelatedprotein30kD)等。Adi

2、ponectin參與能量代謝、炎癥反應(yīng)等生理過程,與肥胖(obesity)、2型糖尿病(Type2diabetesmellitus,T2DM)、動(dòng)脈粥樣硬化(atheroselerosis)、心血管疾病(cardiovasculardisease/CVD)等疾病有密切的關(guān)系。
　　 Adiponectin由247個(gè)氨基酸組成,分子量為30kDa。全長(zhǎng)Adiponectin由四個(gè)部分組成,包含氨基端的信號(hào)序列、可變區(qū)、膠原樣區(qū)和羧

3、基端的球狀結(jié)構(gòu)域。血漿中Adiponectin的存在形式包括同源三聚體、六聚體和更多亞單位組成的更大的復(fù)合體形式,以及由蛋白酶酶切產(chǎn)生的球狀結(jié)構(gòu)域單體形式。Adiponectin球狀結(jié)構(gòu)域(globulardomainofAdiponectin,gAdiponectin)是其活性結(jié)構(gòu)域,是其發(fā)揮生物學(xué)功能的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。
　　 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明Adiponectin可以降低血循環(huán)中FFA和TG的水平;降低血糖和改善機(jī)體的胰島素抵抗?fàn)顟B(tài),

4、而且長(zhǎng)期小劑量的注射重組的Adiponectin可以在不影響食欲的情況下降低體重。研究發(fā)現(xiàn)gAdiponectin比全長(zhǎng)Adiponectin具有更強(qiáng)的生物學(xué)活性。所以將gAdiponectin開發(fā)成具有降低血糖、血脂和減肥多重功能的一類新藥是非常有意義的。目前并沒有一種能夠高效制備gAdiponectin的方法,國(guó)外也因?yàn)間Adiponectin的制備不能滿足實(shí)驗(yàn)需要而退出三期臨床實(shí)驗(yàn)。
　　 為了能夠簡(jiǎn)單、快速、經(jīng)濟(jì)地大量制

5、備有天然生物學(xué)活性的gAdiponectin,我們選擇巴氏畢赤酵母(Pichia.pastoris)作為表達(dá)系統(tǒng)。巴氏畢赤酵母(Pichia.Pastoris)是近年來發(fā)展起來的一個(gè)十分有效的外源蛋白表達(dá)系統(tǒng),廣泛用于外源蛋白的體外表達(dá)。但是有一些外源蛋白使用的部分密碼子不能被巴氏畢赤酵母蛋白翻譯系統(tǒng)有效識(shí)別和翻譯,而需要將部分非畢赤酵母偏愛的密碼子突變成畢赤酵母偏愛的密碼子,外源蛋白才能在畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)中得到有效的表達(dá)。
　　

6、 我們將gAdiponectincDNA中部分非畢赤酵母偏愛密碼子同義突變?yōu)楫叧嘟湍钙珢鄣拿艽a子,然后將突變的gAdiponectincDNA克隆到pPIC9K表達(dá)質(zhì)粒中,轉(zhuǎn)化至畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng),實(shí)現(xiàn)了gAdiponectin的分泌表達(dá),獲得了高效表達(dá)人gAdiponectin的多拷貝轉(zhuǎn)化子作為工程種子菌。
　　 為了大量地制備gAdiponectin,我們利用30L發(fā)酵罐進(jìn)行高密度發(fā)酵,工程菌生長(zhǎng)18小時(shí),菌密度OD600達(dá)

7、到150左右時(shí),甲醇誘導(dǎo)培養(yǎng)30小時(shí),菌密度可達(dá)到350。目的蛋白表達(dá)水平超過lOOmg/L。發(fā)酵上清超濾濃縮、脫鹽后,經(jīng)離子交換、凝膠過濾兩步純化,可以得到純度大于95％的rh-gAdiponectin。
　　 我們利用巴氏畢赤酵母系統(tǒng)表達(dá)人gAdiponectin,工藝流程操作簡(jiǎn)單、周期短、成本低,目的蛋白以可溶的活性形式分泌到培養(yǎng)基中。和已報(bào)道的gAdiponectin制備方法相比,既避免了目的蛋白的復(fù)性過程,也縮短了生產(chǎn)

8、周期,降低了成本,提高了產(chǎn)率。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明rh-gAdiponectin具有明顯的降血糖、降血脂的功能。這就為將rh-gAdiponectin開發(fā)成適用于臨床的藥物奠定了基礎(chǔ)。
　　 Adiponectin(脂聯(lián)素)作為一個(gè)具有廣泛生物學(xué)功能的脂肪細(xì)胞因子,對(duì)于體內(nèi)多種器官和細(xì)胞都有其特有的作用。那么除了已有的關(guān)于脂聯(lián)素的多種生物學(xué)功能的報(bào)道之外,脂聯(lián)素還有沒有其他的功能呢?有研究表明,肥胖患者骨質(zhì)疏松的發(fā)病率較低。提示能量代謝

9、和骨代謝可能受到同類因子的調(diào)控。已經(jīng)有報(bào)道顯示脂肪細(xì)胞因子是調(diào)控骨代謝的一類重要的細(xì)胞因子。Leptin(瘦素)是第一個(gè)被報(bào)道的具有抑制骨形成的脂肪細(xì)胞因子。同時(shí)臨床流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn),Adiponectin(脂聯(lián)素)的循環(huán)水平也和骨質(zhì)疏松的發(fā)病呈一定的負(fù)相關(guān),說明Adiponectin可能具有負(fù)性調(diào)控骨形成的功能。目前有一些報(bào)道顯示,全長(zhǎng)的Adiponectin可以刺激成骨細(xì)胞增殖和分化,也有報(bào)道顯示其抑制骨形成,所以Adiponect

10、in對(duì)成骨細(xì)胞分化和骨形成到底具有什么功能,目前還沒有定論。我們建立了成骨細(xì)胞分化模型,研究重組人gAdiponectin其對(duì)成骨細(xì)胞分化的作用。
　　 在體內(nèi),成骨細(xì)胞是由間充質(zhì)干細(xì)胞分化而來的。在成骨細(xì)胞分化過程中,有兩個(gè)十分關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄因子:Runx2和Osterix。它們調(diào)控成骨細(xì)胞特異蛋白(如:堿性磷酸酶,骨鈣素,膠原等)的表達(dá)、細(xì)胞外基質(zhì)的鈣化和成骨細(xì)胞的分化、成熟。
　　 我們首先在體外成功建立了MC3T3-