脂聯(lián)素對(duì)大鼠成骨細(xì)胞成骨分化中TGF-β1和Runx2表達(dá)的影響.pdf

1、目的：原代培養(yǎng)大鼠成骨細(xì)胞，探討成骨細(xì)胞受脂聯(lián)素作用后生物學(xué)行為的改變；檢測(cè)不同濃度脂聯(lián)素作用下成骨細(xì)胞TGF-β1和Runx2基因和蛋白表達(dá)的變化，探討脂聯(lián)素對(duì)骨改建的作用及其可能作用機(jī)制。
　　方法：
　　1、脂聯(lián)素對(duì)大鼠成骨細(xì)胞成骨分化的影響
　?、佟⒉捎枚蚊赶ㄟM(jìn)行大鼠成骨細(xì)胞原代培養(yǎng)，倒置顯微鏡觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)。經(jīng)礦化誘導(dǎo)14天后，用茜素紅鈣結(jié)節(jié)染色，進(jìn)行成骨細(xì)胞鑒定；
　　②、取第3-5代生長(zhǎng)良好

2、的成骨細(xì)胞，用濃度為4μg/ml脂聯(lián)素作用成骨細(xì)胞0、1、3、5、7、9d，采用MTT法檢測(cè)脂聯(lián)素對(duì)成骨細(xì)胞增殖活性的影響；
　　③、取第3-5代成骨細(xì)胞，用濃度為4μg/ml脂聯(lián)素作用成骨細(xì)胞0、1、3、5、7、9d，檢測(cè)脂聯(lián)素對(duì)成骨細(xì)胞表達(dá)堿性磷酸酶活性的影響；④、取第3-5代成骨細(xì)胞，分別用0、1、2、4、8μg/ml濃度脂聯(lián)素作用7d，使用ELISA法檢測(cè)TGF-β1和Runx2蛋白的表達(dá)水平；
　　2、脂聯(lián)素對(duì)大鼠

3、成骨細(xì)胞成骨分化作用通路的研究
　　①、用濃度為5μmol/L的TGF-β1抑制劑SB431542，分別預(yù)處理成骨細(xì)胞15min、30min、1h、2h、4h，再加入濃度為4μg/ml脂聯(lián)素培養(yǎng)成骨細(xì)胞7d。分別用濃度為0、1、2.5、5、10、20μmol/L的TGF-β1抑制劑SB431542，預(yù)處理成骨細(xì)胞2h，再加入濃度為4μg/ml脂聯(lián)素培養(yǎng)成骨細(xì)胞7d。分別采用MTT法檢測(cè)TGF-β1抑制劑SB431542對(duì)成骨細(xì)胞增

4、殖活性的影響，確定TGF-β1抑制劑SB431542發(fā)揮作用的最適濃度和作用時(shí)間；
　?、?、ELISA法檢測(cè)TGF-β1抑制劑拮抗脂聯(lián)素對(duì)TGF-β1蛋白表達(dá)的影響。分為5組，對(duì)照組：不加入脂聯(lián)素，不加入SB431542；APN組：只加入濃度為4μg/ml的脂聯(lián)素；SB431542+APN組：用濃度為5μmol/L的SB431542預(yù)處理2h后，再加入濃度為4μg/ml的脂聯(lián)素；SB431542組：只用濃度為5μmol/L的SB4

5、31542預(yù)處理2h；DMSO組：加入DMSO。各組成骨細(xì)胞分別培養(yǎng)7d后，ELISA法檢測(cè)TGF-β1蛋白的表達(dá)；
　?、?、RT-qPCR法檢測(cè)TGF-β1抑制劑拮抗脂聯(lián)素對(duì)Runx2 mRNA表達(dá)的影響。分為5組，對(duì)照組：不加入脂聯(lián)素，不加入SB431542；APN組：只加入濃度為4μg/ml的脂聯(lián)素；SB431542+APN組：用濃度為5μmol/L的SB431542預(yù)處理2h后，再加入濃度為4μg/ml的脂聯(lián)素；SB431

6、542組：只用濃度為5μmol/L的SB431542預(yù)處理2h；DMSO組：加入DMSO。各組成骨細(xì)胞分別培養(yǎng)7d后，RT-qPCR檢測(cè)Runx2 mRNA的表達(dá)。
　　結(jié)果：
　　1、脂聯(lián)素對(duì)大鼠成骨細(xì)胞成骨分化的影響
　　①倒置顯微鏡觀察，成骨細(xì)胞接種24 h后細(xì)胞充分鋪展，形態(tài)多樣，呈三角形、梭形、多角形等不規(guī)則形。細(xì)胞爬滿(mǎn)瓶底后可呈復(fù)層生長(zhǎng)，并在局部聚集成灶，形成鈣結(jié)節(jié)，通過(guò)茜素紅染色法可使鈣結(jié)節(jié)染成橘紅色。②

7、MTT結(jié)果顯示：脂聯(lián)素作用成骨細(xì)胞后，OD值持續(xù)升高，在7d達(dá)到高峰（P＜0.05），之后便呈下降趨勢(shì)，時(shí)間到9d時(shí)，OD值仍高于對(duì)照組（P＜0.05）。
　?、蹓A性磷酸酶活性檢測(cè)顯示：脂聯(lián)素作用成骨細(xì)胞后，堿性磷酸酶活性逐漸增高，在7d達(dá)最高水平（P＜0.05），之后便呈下降趨勢(shì)，時(shí)間到9d時(shí)，OD值仍高于對(duì)照組（P＜0.05）。
　　④ELISA檢測(cè)顯示：成骨細(xì)胞在不同濃度脂聯(lián)素作用后，TGF-β1和Runx2蛋白的表達(dá)

8、均上調(diào)，濃度在4μg/ml時(shí)，TGF-β1和Runx2蛋白的表達(dá)量最高，各組組間差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。
　　2、脂聯(lián)素對(duì)大鼠成骨細(xì)胞成骨分化作用機(jī)制的研究
　?、費(fèi)TT檢測(cè)顯示：用不同濃度的TGF-β1抑制劑SB431542，分別預(yù)處理成骨細(xì)胞不同時(shí)間后，OD值均下降，OD值在抑制劑濃度為5μmol/L，作用時(shí)間為2h時(shí)最低（P＜0.05），各組組間差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。②ELISA檢測(cè)顯示：APN組

9、可明顯上調(diào)TGF-β1蛋白的表達(dá)，與對(duì)照組比較（P＜0.05）；SB431542+APN組可顯著阻斷脂聯(lián)素對(duì)TGF-β1蛋白表達(dá)的上調(diào)作用，APN組與SB431542+APN組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；對(duì)照組、SB431542組、DMSO組間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。
　?、跼T-qPCR檢測(cè)顯示：與對(duì)照組相比，APN組可明顯上調(diào)Runx2 mRNA的表達(dá)（P＜0.05）；SB431542+APN組可明顯降低脂聯(lián)

10、素對(duì)Runx2 mRNA表達(dá)的上調(diào)作用，APN組與SB431542+APN組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；對(duì)照組、SB431542組、DMSO組間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。
　　結(jié)論：
　　1、脂聯(lián)素作用成骨細(xì)胞后，可通過(guò)增加TGF-β1和Runx2的合成，促進(jìn)成骨細(xì)胞的成熟和分化，進(jìn)而參與調(diào)節(jié)骨改建。
　　2、TGF-β1抑制劑阻斷脂聯(lián)素對(duì)成骨細(xì)胞TGF-β1和Runx2表達(dá)的上調(diào)作用，TGF-β1和R