脫氧雪腐鐮刀菌烯醇對小鼠成骨細胞RUNX2基因表達的影響.pdf

1、目的：探討小鼠成骨細胞的兩種原代培養(yǎng)方法。使用流式細胞儀檢測小鼠成骨細胞的周期和凋亡，探討脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(deoxynivalenol，DON)對小鼠成骨細胞的毒性作用；檢測DON毒素對小鼠成骨細胞Runx2基因表達情況的影響；為進一步研究真菌毒素造成骨骼發(fā)育不良及畸形的作用機制提供理論依據(jù)。
　　 方法：采用組織塊法和膠原酶分段消化法，從乳鼠的頂骨及顱骨中培養(yǎng)原代細胞。采用茜素紅、堿性磷酸酶染色法鑒定。用不同濃度的DON(

2、0，100，500，1000ng/ml)分別作用于小鼠成骨細胞24小時。使用PI單染后，采用流式細胞技術檢測DON對細胞周期分布的影響；AV-PI雙染后，采用流式細胞技術檢DON對細胞凋亡的影響。提取細胞總RNA，采用半定量PCR、實時熒光定量PCR技術檢測Runx2基因在不同濃度DON毒素的影響下的表達趨勢。
　　 結果：⑴原代培養(yǎng)及鑒定兩種原代培養(yǎng)方法均能成功獲得小鼠成骨細胞。通過組織塊培養(yǎng)法得到的原代細胞量少，耗時長，但純

3、度較高；通過Ⅱ型膠原酶分段消化法得到的原代細胞數(shù)量多，耗時短，但雜細胞較多，需純化。茜素紅、堿性磷酸酶染色結果為陽性，證實所取原代細胞為成骨細胞。⑵DON對細胞周期的影響通過流式細胞儀檢測的結果顯示，在不同濃度DON的影響下，成骨細胞增周期分布出現(xiàn)變化。其中100ng/ml、200ng/ml組與空白對照組相比，細胞周期分布差異不明顯，結果無統(tǒng)計學意義。當DON濃度在500ng/ml以上時，與空白對照組的區(qū)別顯著。500ng/mlDON作

4、用于細胞時，S期細胞的比例開始增多，G2/M期細胞的比例開始減少。1000ng/ml組DON作用于細胞時，S期細胞比例明顯增多，G2/M期細胞比例明顯減少。細胞出現(xiàn)S期阻滯，可能與DNA合成受到抑制有關。實驗證明DON可影響小鼠成骨細胞周期分布，具有明顯的抗增殖作用。⑶DON對細胞凋亡的影響通過流式細胞儀檢測細胞凋亡的結果分析顯示，不同濃度的DON毒素作用于小鼠成骨細胞24小時后，隨DON濃度的增加，細胞早期凋亡與晚期凋亡均呈現(xiàn)增加的趨

5、勢。100ng/ml、200ng/ml組早期凋亡和晚期凋亡與空白對照組相比，差異無統(tǒng)計學意義。500ng/ml組作用于細胞時，UR、LR象限細胞比例上升，凋亡率開始增加。800ng/ml、1000ng/ml組UR、LR象限細胞數(shù)明顯增多，細胞發(fā)生凋亡率增加顯著。說明DON可誘導小鼠成骨細胞發(fā)生凋亡，凋亡率與使用的DON濃度正相關。⑷DON對Runx2基因表達的影響半定量PCR結果顯示：凝膠上200-300bp之間出現(xiàn)亮度基本均一的內參條

6、帶，300-400bp之間出現(xiàn)亮度逐漸降低的目的條帶。在內參條帶亮度一致的條件下，目的基因條帶的亮度隨DON濃度的增加，亮度逐漸降低。說明隨著DON的增加，由Runx2轉錄的mRNA的含量逐漸減少。⑸熒光實時定量PCR結果熒光實時定量PCR結果顯示：各組內參Ct值基本一致。各實驗組Runx2基因表達量與空白對照組的關系為：100ng/ml組約為空白對照組的72.8％，500ng/ml組約為空白對照組的60.9％，1000ng/ml組約為